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特发性血小板减少性紫癜患者糖皮质激素受体的表达
目的探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者糖皮质激素治疗效应与外周血单个核细胞(PBMC)内两种糖皮质激素受体(GR)亚型-GRα和GRβ,及C-FOX表达水平之间的关系.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测激素敏感型、激素抵抗型ITP患者和正常对照组GRα,GRβ,C-FOX的mRNA的表达.结果ITP患者和正常对照组均有GRα、cRβ,C-FOS mRNA的表达;激素抵抗型ITP患者GRβ mRNA表达明显高于激素敏感型ITP患者及正常对照组(P＜0.05);GRα,C-FOX mRNA在各组无显著差别.结论ITP患者糖皮质激素抵抗可能与GRβ的表达亢进有关.
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儿童眼肌型重症肌无力外周血单个核细胞中糖皮质激素受体的表达分析
目的 重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫性疾病(autoimmunity diseases,AID),在其他AID研究中发现糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)表达有异常,故有必要探讨儿童MG中GR表达情况.方法 对新发MG患儿43例及健康儿童19例留取新鲜血液,分离外周血单个核细胞(PBMC)选用RT-PCR法检测GRα、GRβ亚型mRNA表达水平;用免疫细胞化学法观察两组患儿PBMC中GRα、GRβ阳性细胞比例.结果 MG患儿GRα(0.639±0.253)、GRβ(0.508±0.153)阳性细胞比例较对照组(分别为0.344±0.097;0.315±0.127)明显升高(P<0.05),MG患儿GRα(0.698±0.155)、GRβ(0.587±0.236)mRNA表达水平较对照组(分别0.521±0.106;0.471±0.161)显著升高(P<0.05).结论 MG患儿PBMC中GRα、GRβ表达增高可能与GR功能异常有关,这可导致GR释放糖皮质激素(glucocorticoid,GC)受限,故GC的有效利用率下降,从而引起机体内环境紊乱.
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糖皮质激素受体β在肥胖哮喘大鼠气道平滑肌中的表达
目的 观察糖皮质激素受体β在肥胖哮喘大鼠气道平滑肌中的表达情况,探讨肥胖哮喘易发生激素抵抗的可能机制.方法 将40只雄性SD大鼠随机分为正常体重组和肥胖组,正常体重组进一步分为正常体重对照组(A组)和正常体重哮喘组(B组),肥胖组进一步分为肥胖对照组(C组)和肥胖哮喘组(D组).正常体重组大鼠给于基础饲料,肥胖组大鼠给于高能饲料,B、D两组鸡卵蛋白(OVA)多次腹腔注射和反复雾化激发以建立哮喘模型,A、C组以生理盐水代替OVA.末次激发后24h处死大鼠,体外原代培养大鼠ASMC,Western-blot法检测各组GRβ蛋白表达.结果 Western blot检测显示:B、C两组细胞GRβ蛋白表达量(分别为0.40±0.02,0.37±0.05)均较A组蛋白表达量(0.17±0.03)明显增加(均P＜0.05),均较D组蛋白表达量(0.48±0.02)明显减弱(均P＜0.05),而B、C两组蛋白表达量之间无明显差异(P＞0.05).结论 肥胖哮喘大鼠较正常体重大鼠ASMCGRβ的表达明显升高,其可能是肥胖哮喘易发生激素抵抗的作用机制之一.
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掌跖脓疱病患者皮损糖皮质激素受体α和β表达的研究
目的:为了解掌跖脓疱病患者皮损中GR表达情况,我们利用免疫组化方法检测患者皮损和正常皮肤标本中GR-α和GR-β的表达,从而探讨其表达在发病中的作用.方法:选择25例临床诊断为掌跖脓疱病患者皮损,26例外科手术切取的健康皮肤作为正常对照.用免疫组化SP法(链酶卵白素—过氧化物酶法)检测掌跖脓疱病患者皮损与正常对照组皮肤GR-α、GR-β的表达数量和强度.结果:两组GR-α表达无显著差异,患者组GR-β表达阳性率及强度明显高于对照组.结论:GR-β在掌跖脓疱病的发病过程中起重要作用.
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乌司他丁对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织糖皮质激素受体α和β表达的影响
目的 探讨乌司他丁对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠肺组织糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)、糖皮质激素受体β(glucocorticoid receptor beta,GRβ)表达的影响.方法 将72只成年雄性SD大鼠随机分为3组:空白对照组(n=24)、脂多糖组(LPS组,n=24)和脂多糖加乌司他丁组(LU组,n=24),各组又分为4、8、12、24 h4个不同时间点,每个时间点各6只.LPS组腹腔注射LPS(5 mg/kg);LU组腹腔注射LPS(5 mg/kg)后,即刻腹腔注射乌司他丁(10万U/kg).各组补足生理盐水至腹腔注射总体积为1 ml.光镜下观察肺组织HE染色病理学变化;同时测定大鼠肺湿干重比(W/D);采用蛋白印迹分析技术检测GRα、GRβ的表达.以灰度值表示其相对表达水平.结果 病理检查证实大鼠ALI造模成功.在各时间点3组大鼠肺组织GRα、GRβ的表达:LPS组大鼠肺组织GRα表达水平均低于对照组(P均＜0.01),GRβ均高于对照组(P均＜0.01);LU组GRα表达水平均高于LPS组(P均＜0.05),但仍低于对照组(P均＜0.05),GRβ与GRα相反.LPS组内各时间点肺组织GRα、GRβ表达水平比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),GRα于8h降到低,然后递升;GRβ于8h达到高,然后递降.LU组内各时间点肺组织GRα、GRβ表达水平比较差异有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01),随时间延长GRα表达递降,GRβ递增并于8h达到高,然后递降.结论 ALI大鼠GRα和GRβ在肺组织中的表达较正常肺组织有所改变,乌司他丁对ALI大鼠有保护作用,可能与其可调控GRα和GRβ的表达有关.
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大鼠自身免疫性甲状腺炎中西药疗效与糖皮质激素受体的相关性研究
目的 慢性自身免疫性甲状腺炎为临床常见的甲状腺疾患,中医药在治疗本病时有独特优势.方法 自身免疫性甲状腺炎模型大鼠经由加味逍遥丸和优甲乐治疗后,2组疗效相比较,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测GRα、GRβ的表达.结果 中药治疗组的大鼠TgAb和TPOAb均显著下降;淋巴细胞浸润范围减小、程度减轻.各组均有GRα和GRβ蛋白表达,模型组GRα的表达量低于正常对照组;而GRβ的蛋白表达量及细胞核GRβ/GRα比值均高于对照组,提示在疾病过程中GRα为负性作用因子,GRβ为正性作用因子,经由中药干预后,调节免疫相关因子GRα和GRβ抑制自身免疫反应.结论 探讨GR基因表达在自身免疫性甲状腺炎发病机制中的作用,探究慢性甲状腺炎区别治疗的依据.
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GRβ shRNA稳定表达胶质瘤细胞株的构建及功能初探
目的:构建并鉴定糖皮质激素受体β (GRβ)RNA干扰稳定表达胶质瘤细胞株,研究GRβ对胶质瘤细胞周期及增殖的影响.方法:根据GRβ mRNA序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),以LipofectamineTM 2000转染人胶质瘤细胞,RT-PCR及Western blot鉴定其有效性;体外合成该siRNA插入序列小发卡RNA(shRNA)并定向克隆至真核表达载体pGPH 1/GFP/Neo,转染后,通过G418筛选稳定表达细胞株(G0306),Western blot检测GRβ表达、MTS和流式细胞术检测GRβ干扰对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响.结果:GRβsiRNA能有效抑制GRβ的表达,DNA测序证实合成并克隆人真核表达载体pGPH1/GFP/Neo的shRNA序列完全正确;GRβshRNA稳定表达人胶质瘤细胞株阻滞于G1期、细胞增殖能力显著下降.结论:成功构建人GRβshRNA稳定表达胶质瘤细胞株(G0306),初步表明GRβ影响胶质瘤细胞的增殖,为后期研究GRβ在中枢神经系统肿瘤中的作用及机制奠定了基础.
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儿童原发性肾病综合征外周血糖皮质激素受体β及热休克蛋白90的变化及其意义
目的 探讨原发性肾病综合征(PNS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)上糖皮质激素受体β(GRβ)及热休克蛋白90(HSP90)与糖皮质激素治疗效应之间的关系.方法 以30例PNS患儿作为观察组,根据随访结果分成激素耐药型肾病综合征(SRNS)和激素敏感型肾病综合征(SSNS)2组,各15例.10例健康儿童作为正常对照组.应用RT-PCR检测了各组PBMC上GRβmRNA及HSP90mRNA的表达；并分析以上指标与肾脏病理及相关临床实验室指标的关系.结果 (1) SSNS组患儿PBMC上GRβmRNA、HSP90mRNA的表达均高于对照组(均P＜0.05).(2)SRNS组患儿PBMC上GRβmRNA、HSP90mRNA的表达均高于SSNS组(均P＜0.01).(3)SRNS组患儿PBMC上GRβmRNA的表达与肾脏病理分级成等级正相关(r=0.496,P＜0.05)；与24h尿蛋白定量(24 h UTP)成等级正相关(r =0.458,P＜0.05).(4) SSNS组患儿PBMC上GRβmRNA的表达与24 h UTP无相关性(P＞0.05).结论 GRβ及HSP90可能参与了SRNS的发生与发展.GRβ可以作为监测PNS患儿病情以及预后的指标之一.
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糖皮质激素受体与褪黑素受体在斑秃皮损中的表达
目的:检测斑秃(AA)患者皮损及健康头皮标本中糖皮质激素受体(GR)和褪黑素受体(MR)的表达.方法:用免疫组化法检测15例AA患者和16例正常对照组GR-α、GR-β、MR1的表达.结果:GR-α的表达在AA组明显强于健康组(P＜0.05);在毛囊生长期和静止期细胞中AA组GR-α的表达强于健康组(P＜0.01);GR-β在AA组与健康组的表达无统计学意义(P＞0.05);MR1在AA组表皮层表达弱于健康组(P＜0.05);在真皮间质炎细胞中AA组高于健康组,并与间质炎细胞分布关系密切(P＜0.05).结论:GR-α不仅在正常毛发生长中起着重要作用,而且通过对毛囊生长期和静止期的影响参与了斑秃的发生.
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人糖皮质激素受体β与绿色荧光蛋白融合基因共表达慢病毒载体的构建
目的:构建人糖皮质激素受体(GR)β与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体.方法:采用基因重组技术从人胚脑表达文库内获得人GRβ cDNA,双酶切法将目的片段克隆人pGC-LV载体中,获得重组载体pGC-FU-GRβ.测序正确的质粒pGC-FU-GRβ通过脂质体Lipofectamine 2000转染293T细胞.通过荧光检测和Western Blot检测鉴定慢病毒表达载体质粒.与辅助包装质粒转染293T细胞,包装后产生病毒液,Real-time PCR法测定其滴度.结果:成功构建人GRβ-GFP重组慢病毒表达载体,转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,Western Blot检测到GRβ-GFP融合蛋白的表达.Real-time PCR测定病毒滴度为2.00E+8 TU/ml.结论:成功构建了人GRβ与GFP基因共表达的慢病毒表达载体,为探讨以激素为首选药物的慢性鼻-鼻窦炎等疾病治疗中GRβ与激素治疗敏感及抵抗的关系,提供了稳定的感染细胞载体.
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GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响
目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响.方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因测序和蛋白质印迹分析鉴定所构建的细胞株,应用MTT法和流式细胞术检测细胞内不同表达水平的GRβ对地塞米松的细胞增殖抑制效应和细胞周期变化的影响.结果:构建的肾小球系膜细胞分别有正确的GRβ正义和反义基因整合,转染了GRβ正义基因的肾小球系膜细胞内GRβ蛋白质表达水平明显高于转染了GRβ反义基因者(109.74±10.63 vs.19.08±1.01,P＜0.05);地塞米松对GRβ高表达的肾小球系膜细胞的增殖抑制效率显著低于GRβ低表达的肾小球系膜细胞(18.47%±2.12% vs.60.33%±5.29%,P＜0.05).在地塞米松的抑制下,转染了正义GRβ基因的细胞中,其S期细胞降低程度和G1期细胞升高的程度均明显低于未转染的细胞.结论:肾小球系膜细胞内高表达的GRβ具有拮抗糖皮质激素效应的作用,细胞内GRβ表达水平是决定细胞对激素敏感或抵抗的重要因素.
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瘦素增加肥胖哮喘性大鼠气道平滑肌细胞糖皮质激素受体β的表达
目的 观察哮喘性大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)在有无瘦素(Leptin,LP)干预的情况下,其糖皮质激素受体β(glucocorticoid receptor,GR-β)表达的变化,探讨肥胖哮喘易发生激素抵抗的可能机制.方法 将40只雄性SD大鼠随机分为正常体质量组和肥胖组,正常体质量组进一步分为正常体质量对照组(A组)和正常体质量哮喘组(B组),肥胖组进一步分为肥胖对照组(C组)和肥胖哮喘组(D 组).正常体质量组大鼠给予基础饲料,肥胖组大鼠给予高能饲料以复制肥胖模型,鸡卵蛋白(OVA)多次腹腔注射和反复雾化激发以复制哮喘模型.末次激发后24 h处死大鼠,体外原代培养大鼠ASMC.RT-PCR法分别测定A、B、C、D组细胞瘦素受体(OB-R)mRNA的表达;分别用生理盐水(NS)和LP(50 ng/ml)干预A、B、C、D组细胞48 h,Western blotting法检测各组GR-β蛋白表达.结果 RT-PCR电泳结果示在500 bp处有明显条带,其大小与OB-R目的基因片段大小相符,说明AMSC上有OB-R表达,且B组(0.389±0.046)、C 组(0.404±0.037)OB-R表达量均较A组(0.305±0.043)明显增高(均P＜0.05),均较D组(0.552±0.066)明显降低(均P ＜0.05),而B、C两组OB-R表达量之间差异无统计学意义(P＞005).Western blotting检测显示,在NS干预的情况下,B、C两组细胞GR-β蛋白表达量分别为(0.40±0.02)和(0.37±0.05),均较A组蛋白表达量(0.17±0.03)明显增加(均P＜0.05),均较D组蛋白表达量(0.48±0.02)明显减弱(均P＜0.05),而B、C两组蛋白表达量之间差异无统计学意义(P＞0.05).在LP干预的情况下,各组细胞GR-β蛋白表达量均分别较相应的NS干预组的蛋白表达量明显增加(F=377.04,均P＜0.01),且B、C两组细胞GR-β蛋白表达量分别为(0.72±0.03)和(0.71±0.06),仍较A组蛋白表达量(0.42±0.04)明显增加(均P＜0.05),较D组蛋白表达量(0.82±0.05)明显减弱(均P＜0.05),而B、C两组蛋白表达量之间差异仍无统计学意义(P＞0.05).结论 LP可能通过OB-R作用于大鼠ASMC,并能够增加肥胖哮喘大鼠ASMC GR-β的表达,这可能是肥胖哮喘易发生激素抵抗的作用机制之一.
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激素抵抗肾病综合征患者肾组织GRβ和GRα的表达及意义
目的 探讨肾病综合征激素抵抗患者肾脏组织中GRβ和GRα的表达及意义.方法 据糖皮质激素治疗效果将原发性肾病综合征患者分为以下3组:激素敏感组、激素抵抗组、复发后抵抗组.用免疫组织化学方法检测45例原发性肾病综合征患者肾组织中GRβ和GRα的表达,并用计算机图像分析系统对结果进行分析.结果 复发后激素抵抗组和激素抵抗组肾组织中GRβ含量明显高于激素敏感组(P＜0.05);复发后激素抵抗组肾组织中GRβ与激素抵抗组之间差异无统计学意义(P＞0.05);复发后激素抵抗组和激素抵抗组肾组织中GRα含量明显低于激素敏感组(P＜0.05);复发后激素抵抗组肾组织中GRα与激素抵抗组之间差异无统计学意义(P＞0. 05).结论 肾组织中GRβ的升高和GRα降低可能与原发性肾病综合征激素抵抗有关;检测肾组织中GRβ和GRα表达变化有助于预判断预后和调整治疗.
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细菌超抗原SEB对皮炎局部糖皮质激素受体β表达的影响
目的 探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对于皮炎局部糖皮质激素受体β(GRβ)的影响.方法 1％ DNCB重复刺激Balb/c小鼠背部皮肤构建特应性皮炎动物模型,以未经处理的模型小鼠为对照组,并分别用SEB、SEB+地塞米松、地塞米松处理该动物模型.通过H&E染色观察组织病理变化,计数真皮内炎性细胞数量来反映不同处理组皮炎的变化情况,采用 qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法检测糖皮质激素受体β(GRβ)的mRNA和蛋白表达.结果 在利用DNCB构建的Balb/c小鼠特应性皮炎动物模型中,真皮内炎性细胞数量明显增加;与未经处理的皮炎组相比,SEB处理后炎性细胞显著增加,地塞米松处理后炎性细胞显著减少,但SEB可部分拮抗地塞米松的抗炎作用;此外,在SEB处理的皮炎组以及SEB+地塞米松处理的皮炎组,GRβmRNA和蛋白的表达均显著上调,但SEB单独处理的皮炎组GRβ mRNA和蛋白的表达上调情况更为显著.结论 细菌超抗原(SEB)在皮炎局部诱导了GRβ的表达升高,在外用糖皮质激素快速减敏过程中起到了重要的作用.
