乳腺癌组织细胞的高效原代培养及其特性

目的：高效扩增乳腺癌组织细胞，明确其特性，为乳腺癌深入研究及个体化治疗提供实验材料。方法利用小鼠胚胎成纤维细胞3T3swiss作饲养层细胞，培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632，对乳腺癌组织细胞进行原代培养。CCK-8检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞周期；免疫细胞化学检测细胞CK分子表达；RT-PCR检测HER-2， ER，PR及乳腺癌干细胞相关标志分子（如CD44，CD24等）mRNA的表达；STR检测以明确细胞身份。结果在饲养层细胞和Y-27632抑制剂同时存在的情况下，所培养的乳腺癌组织细胞增殖速度较快，可短时间获得大量细胞；细胞呈多角形上皮样，CK、HER-2、ER表达阳性，PR 不表达； CD44和CD24表达阳性；经STR分析证明其身份正确。结论饲养层细胞及ROCK抑制剂有助于乳腺癌组织细胞的原代培养及大量扩增，扩增的细胞性质稳定，可用于个体化治疗研究。

Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨RhoA/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞.将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组.分别于细胞培养后ld、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达.结果 流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs.与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P＜0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P＜ 0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Y-27632阻断RhoA/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化.

能使体外培养细胞长期存活的技术

美国科学家的新研究表明Rho激酶抑制剂(Y-27632)与纤维母细胞饲养细胞合用能够诱导许多组织的正常上皮细胞以及肿瘤上皮细胞在体外无限增值,而不需要转导外源性病毒或细胞基因.例如原始前列腺和乳腺细胞重编程为基底细胞样干细胞样表型并在基底膜中形成有序的前列腺球和乳腺球.相较于筛选稀少的干细胞样细胞,在所述的生长条件下能够在活检组织获取后的5 d～6 d内产生2×106个细胞,能够从冷冻组织少于4个活细胞培养起来.持续的细胞增殖依赖于纤维母细胞饲养细胞和Y-27632两者,进行有条件重组的细胞(CRCs)保持了正常的核型和非致瘤性.该技术也能够有效建立人和啮齿类动物肿瘤细胞的培养系.例如,从人前列腺癌建立的CRCs表现出第13号染色体的不稳定性,在基底膜中的异常增殖以及在有严重合并免疫缺陷的老鼠中形成肿瘤.这种从少量活检样本和冷冻组织迅速产生许多肿瘤细胞的能力为基于细胞的诊断和治疗(包括测试化学敏感性)提供了很大机会并大大提高了生物银行的价值.另外,CRC方法能够对取自体内的上皮细胞进行遗传操作以及随后的自体体内评估.

Rho-associated protein kinase is an essential regulator of cytoskeletal dynamics during the process of neurite extension. However, whether Rho kinase regulates microtubule remodeling or the distri-bution of adhesive proteins to mediate neurite outgrowth remains unclear. By specifical y modulat-ing Rho kinase activity with pharmacological agents, we studied the morpho-dynamics of neurite outgrowth. We found that lysophosphatidic acid, an activator of Rho kinase, inhibited neurite out-growth, which could be reversed by Y-27632, an inhibitor of Rho kinase. Meanwhile, reorganization of microtubules was noticed during these processes, as indicated by their significant changes in the soma and growth cone. In addition, exposure to lysophosphatidic acid led to a decreased brane distribution of vinculin, a focal adhesion protein in neurons, whereas Y-27632 recruited culin to the membrane. Taken together, our data suggest that Rho kinase regulates rat hippocampal neurite growth and microtubule formation via a mechanism associated with the redistribution of vinculin.

舌鳞癌F-肌动蛋白骨架变化对细胞形态的影响

目的 探讨舌鳞癌F-肌动蛋白骨架变化对细胞形态的影响.方法 用不同药物浓度的Rho/ROCK通路特异性抑制剂Y-27632作用于人舌鳞癌Tea8113细胞株,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,用激光扫描共聚焦显微镜观察舌癌细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列和分布的变化.结果 经低浓度处理后,细胞的F-肌动蛋白排列和分布及细胞形态变化不明显,经高浓度处理后,变化明显.结论 F-肌动蛋白骨架变化影响舌鳞癌细胞形态.

ROCK抑制剂对Hep-2细胞生长、侵袭和迁移的作用

目的 用ROCK特异性抑制剂Y-27632处理Hep-2细胞系后,探讨ROCK信号转导通路对细胞的生长、侵袭和迁移的影响.方法 商品化细胞系Hep-2经Rho激酶ROCK抑制剂Y-27632处理后,分别在光镜下观察细胞形态学变化,通过迁移实验和Transwell matrigel侵袭实验及MTT实验,观察细胞运动、迁移增殖能力的变化.结果 经Y-27632处理后,Hep-2细胞的形态明显变化,细胞的侵袭能力明显下降,运动能力下降.结论 ROCK信号转导通路参与Hep-2细胞体外运动、侵袭、迁移的调节.ROCK特异性抑制剂Y-27632可降低Hep-2细胞的侵袭能力,干扰ROCK有望作为喉癌靶向治疗的新靶点,为喉癌的靶向治疗或新基因治疗带来希望.

ROCK抑制剂Y-27632对Hep-2细胞中RhoC及ROCK表达的影响

目的 探讨ROCK抑制剂Y-27632对喉癌细胞系Hep-2中RhoC及ROCK表达的影响.方法 在体外培养的喉癌细胞系Hep-2的培养液中加入ROCK抑制剂Y-27632后,用免疫荧光法,RT-PCR及Western blot检测喉癌细胞Hep-2细胞系RhoC及ROCK-1,ROCK-2的mRNA及蛋白的表达水平.结果 经过Y-27632处理后,Hep-2中RhoC及ROCK-1和ROCK-2在细胞的mRNA及蛋白的表达下降.结论 Y-27632可抑制ROCK-1、ROCK-2及RhoC的表达.

ROCK介导缓激肽开放SD大鼠血肿瘤屏障

目的 利用ROCK的特异性抑制剂Y-27632,研究ROCK是否介导缓激肽开放血肿瘤屏障.方法 应用ROCK的特异性抑制剂Y-27632预处理大鼠原代脑微血管内皮细胞后,用缓激肽诱导血肿瘤屏障开放,测量跨内皮阻抗值(TEER),辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析血肿瘤屏障的通透性的改变；应用Westernblot法检测紧密连接相关蛋白ZO-1的表达；应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白结构和分布的改变.结果 Y-27632显著抑制缓激肽诱导TEER值的降低,HRP的升高；Y-27632显著抑制ZO-1的表达；Y-27632抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,应力纤维形成明显减少.结论 ROCK介导缓激肽开放血肿瘤屏障.

Y-27632抑制缓激肽选择开放血肿瘤屏障的研究

目的 研究Rho associated kinase(ROCK)特异性抑制剂Y-27632是否抑制缓激肽开放血肿瘤屏障.方法 应用EVOM测定仪测定跨内皮阻抗值,分析血肿瘤屏障的通透性;应用辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障的通透性;应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞丝状肌动蛋白结构和分布的改变.结果 BK作用15min时,跨内皮阻抗值低,辣根过氧化物酶流量高,血肿瘤屏障通透性高;此时大鼠脑微血管内皮细胞边界的丝状肌动蛋白分布不连续,应力纤维形成增加.ROCK的特异性抑制剂Y-27632显著抑制了由缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高和应力纤维的增加.结论 Y-27632抑制缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高,可能与丝状肌动蛋白结构和分布的改变和应力纤维的增加相关.

ROCK抑制剂Y-27632促进人角质形成细胞增殖与调控衰老

背景:促进角质形成细胞体外培养增殖能力对皮肤生物学和皮肤相关疾病发病机制的研究具有重要意义.目的:观察Rho激酶抑制剂Y-27632对角质形成细胞增殖与衰老的影响.方法:分离培养人角质形成细胞,通过形态鉴定观察Y-27632(10μmol/L)对角质形成细胞形态的影响;利用群体倍增速率估算Y-27632对角质形成细胞增殖的影响;分别在角质形成细胞第0,5代,通过 β-半乳糖苷酶细胞染色方法检测Y-27632对细胞衰老的作用;进一步通过MTT法和BrdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖情况.结果与结论:人角质形成细胞为大小均一的铺路石样细胞,且在早期具有较强的增殖能力,随着细胞传代,增殖能力降低,且形态变为扁平的,胞浆增大的特点;Y-27632显著提高了细胞的群体倍增速率,通过 β-半乳糖苷酶细胞染色显示,Y-27632降低了阳性细胞数,进一步通过MTT法和BrdU细胞增殖检测法得出,Y-27632促进细胞体外增殖.结果说明,人角质形成细胞体外过程中,Y-27632的加入不仅能够抑制细胞衰老,同时促进其增殖,为角质形成细胞体外扩增培养与研究提供了新思路.

Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化

背景:Y-27632是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶抑制剂,已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用.另外,其对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用.而如何提高胚胎干细胞向类神经元细胞分化是神经损伤修复和神经再生领域热点问题.目的:探讨Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞分化效率的作用.方法:取16代人胚胎干细胞复苏后,进行形态观察和染色鉴定,采用悬浮培养法制备类胚体,培养8 d后,进行分组贴壁培养:对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化;Y-27632组分别在Sato培养基加入5,10, 20,40 μmol/L Y-27632.培养10 d后进行染色鉴定;10-18 d后,进行免疫荧光染色检测胚胎干细胞分化效率和类神经元细胞突起生长情况.结果与结论:①人胚胎干细胞共表达Oct4和SSEA-3干细胞特异蛋白;②悬浮分化培养8 d后,进一步贴壁培养10 d,可观察到具有神经形态,且表达Tuj-1的类神经元细胞;③经不同浓度的Y-27632诱导后,免疫荧光染色发现贴壁细胞数和Tuj-1阳性细胞数显著增加,提示胚胎干细胞向类神经元细胞分化速率加快,且在浓度为10 μmol/L时为明显;④分化培养18 d后,免疫荧光染色显示,与对照组相比,10 μmol/L Y-27632组的Tuj-1阳性细胞数及突起数和突起长度显著增加;⑤结果说明,Y-27632不仅能够促进人胚胎干细胞向类神经元细胞分化,同时促进类神经元细胞突起的生长.

损伤角膜修复重建中的ROCK抑制剂：促进角膜细胞增殖、迁移和黏附

背景：随着人们对Rho/ROCK通路的生物学功能的了解的不断加深，新的ROCK抑制剂不断被发现，且ROCK抑制剂在角膜细胞存活、增殖和迁移中表现出良好的促进效果，ROCK 抑制剂的研究能为再生医学和临床细胞移植提供更多的良好供体材料或种子细胞。目的：总结并探讨ROCK抑制剂Y-39983和Y-27632在角膜病的治疗和应用的研究进展。方法：应用计算机检索PubMed 数据库和中国知网数据库内相关文章，检索时间为2008至2015年，检索词为“corneal endothelial cel，corneal epithelial cel，ROCK inhibitor，Y-39983，Y-27632，ROCK抑制剂，角膜”，从中筛选出与主题相关的部分文献。结果与结论：初检得到264篇文章，按主题相关性对文献进一步筛选，终纳入45篇文章进行讨论。应用到眼科的ROCK抑制剂主要有两种：Y-27632和 Y-39983，两者的应用主要还是基础研究与临床试验阶段。Y-27632可促进角膜缘上皮干细胞增殖及提高冻存复苏后的活性；Y-39983作为一种新型的ROCK抑制剂，其比Y-27632更有效地抑制ROCK激酶的活性，从而能更有效地促进角膜内皮的愈合。目前ROCK抑制剂在角膜治疗的研究较多，但是没有建立一种稳定的获得种子细胞的方法，每一种治疗方法都各有优缺点，而克服这些缺点以及找到快速稳定获得种子细胞的方法是今后的发展方向。

Rho激酶抑制剂Y-27632对急性高眼压大鼠视网膜损伤的保护作用

目的 探讨Rho激酶抑制剂Y-27632对急性高眼压大鼠视网膜损伤的保护作用.方法 50只SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、生理盐水对照组(n=20,玻璃体腔内注射生理盐水)和Y-27632治疗组(n=20,玻璃体腔内注射100 nmolY-27632),选取右眼做为实验眼.正常对照组直接处死取材.生理盐水对照组及Y-27632治疗组分别用前房加压灌注法建立大鼠急性高眼压损伤模型,并于损伤后24和168 h取标本.HE染色观察视网膜组织病理学的改变,测量视网膜厚度；TUNEL染色检测细胞凋亡情况,计算凋亡指数；Western blot检测Caspase-3蛋白表达的变化.结果 急性高眼压损伤24 h后,Y-27632治疗组视网膜凋亡细胞数量和Caspase-3蛋白表达水平均低于生理盐水对照组(P＜0.01).损伤168 h后Y-27632治疗组视网膜厚度大于生理盐水对照组(P＜0.01).结论 Y-27632可以减轻大鼠急性高眼压引起的视网膜损伤,具有神经保护作用.

Rho/Rho激酶信号通路在缺氧性肺血管收缩中的机制

目的 探讨15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)致大鼠肺动脉收缩的信号转导途径,阐明15-HETE引起慢性缺氧性肺动脉收缩作用的可能机制.方法 采用组织浴槽血管环方法测量15-HETE对缺氧模型组、正常组大鼠血管收缩作用,并观察加入Rho激酶抑制剂Y-27632后肺动脉环收缩强度的改变,明确Rho/Rho激酶信号转导途径在15-HETE收缩肺动脉中的作用.结果 15-HETE对正常组、缺氧模型组大鼠血管环均有收缩作用,当加入Rho激酶抑制剂Y-27632可明显阻断15-HETE对缺氧大鼠肺动脉的收缩作用(P＜0.05).结论 15-HETE通过Rho/Rho激酶信号转导途径收缩慢性缺氧性大鼠肺动脉.

Rho/Rho激酶信号通路与支架内再狭窄的研究

血管支架作为一种有效治疗心脑血管硬化手段得到广泛的研究和应用.血管支架内再狭窄的发生难以避免.支架内再狭窄是由血管平滑肌分化、迁移,细胞外基质的过度生成所致的病理生理过程.Rho激酶参与支架植入引起的新生内膜增生的调节.长期抑制Rho激酶的表达可阻止新生内膜的增生,可能成为防止支架内再狭窄的一种方法.

ROCK抑制剂对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响

目的 研究ROCK特异性抑制剂Y-27632对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响,并探讨其可能的机制.方法 体外培养人食管癌株EC9706,加入20μmol/L的Y-27632溶液(实验组)及等体积的PBS(对照组)培养1h,采用细胞计数、MTT实验检测细胞生长情况,采用Transwell实验观察细胞迁移情况,采用Western blot检测Cav-1的表达水平,并进行两组的比较.结果 细胞计数、MTT、Transwell实验结果显示,Y-27632可以抑制细胞的生长与迁移能力,与对照组比较差异有统计学意义(P均＜0.05).Western blot检测结果显示,Y-27632处理细胞1h后,Cav-1蛋白表达水平明显下降,并明显低于对照组(P均＜0.05).结论 ROCK信号通路参与EC9706细胞生长与迁移的调节,Y-27632可以抑制EC9706细胞的生长及迁移能力,其机制可能与下调Cav-1的表达有关.

ROCK抑制剂对TE13细胞生长及迁移能力的影响

目的 通过在体外用Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)特异性抑制剂Y-27632处理人食管癌细胞株TE13,观察Y-27632对TE13的生长及迁移能力的影响,并探讨其可能机制.方法 体外培养人食管癌株TE13,分别用不同浓度的Y-27632(2.5、5、10、20 μmol/L)处理细胞24h,对照组加等体积PBS,采用细胞计数、MTT检测细胞生长情况,采用划痕实验观察细胞的迁移能力,采用Western blot检测小窝蛋白(cav)-1的表达水平.结果 Y-27632可以促进细胞的生长与迁移能力,随着时间的增加促进效果越明显,与对照组比较存在明显差异(P＜0.05).Y-27632可以上调cav-1表达水平.结论 ROCK信号通路参与TE13细胞生长与迁移的调节,Y-27632可以增加TE13细胞的生长及迁移能力,其机制可能与上调cav-1的表达有关.

Rho/Rho激酶在哮喘小鼠气道的表达及其对气道重塑的影响

目的 研究Rho/Rho激酶(ROCK)信号通路在哮喘小鼠气道中的表达及其对气道重塑的作用.方法 清洁级BALB/c雄性小鼠39只,随机分为对照组、哮喘组、Y-27632干预组、地塞米松干预组,每组10只(其中对照组9只).建立哮喘小鼠模型,并应用ROCKⅡ特异性拮抗剂Y-27632进行干预,光镜观察肺组织结构,Image-pro plus图像分析软件测量支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam),免疫组化法测定肺组织ROCKⅡ蛋白含量,RT-PCR法测定RhoA、ROCKⅡ mRNA含量.结果 ⑴哮喘组小鼠RhoA、ROCKⅡ表达明显增高,应用ROCKⅡ特异性拮抗剂Y-27632能够下调RhoA、ROCKⅡ的表达.⑵ Y-27632干预组小鼠Wat和Wam均明显低于哮喘组小鼠.结论 哮喘小鼠肺组织RhoA及ROCKⅡ表达增多,ROCKⅡ受体拮抗剂Y-27632能够下调RhoA、ROCKⅡ的表达,明显抑制哮喘小鼠Wat和Wam.

抑制Rho/Rho激酶信号对动脉粥样硬化大鼠心血管系统的保护作用

目的 探讨抑制Rho/Rho激酶信号对动脉粥样硬化(AS)过程中心血管系统的保护作用.方法 实验设置对照组、模型组、Y-27632低剂量组、Y-27632高剂量组,采用高脂饮食配合钙超载的方法建立大鼠AS模型,并给予Y-27632抑制Rho/Rho激酶信号通路.末次给药后颈动脉取血检测血清TC、HDL,HE染色检测心肌组织病理改变,Western blot法检测肌球蛋白磷酸酶抗体(MYPT-1)磷酸化情况,RT-PCR检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、I型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的表达.结果 模型组大鼠血清HDL含量降低(P＜0.05),TC、AS指数升高(P均＜0.05),心肌松散、细胞排列紊乱；与模型组相比,Y-27632低、高剂量组TC含量以及AS指数降低(P均＜0.05),心肌组织状态得到明显恢复；模型组MYPT-1磷酸化水平以及PAI-1 mRNA的表达升高(P均＜0.05),而与模型组相比Y-27632低、高剂量组显著降低(p均＜0.05)；模型组eNOS mRNA表达显著降低(P＜0.05),与模型组相比Y-27632低、高剂量组显著升高(P均＜0.05).结论 采用Y-27632抑制Rho/Rho激酶信号通路,能够减缓AS进程从而保护心血管系统.

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的:初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响.方法:采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液十抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况.结果:MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G0/G1期细胞比例为(66.8±6.84)％,S期细胞比例为(25.17±0.62)％,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)％,S期细胞比例为(31.34±1.16)％,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P＜0.05).结论:Rho激酶抑制剂Y-27632促进入牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖.