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一种快速构建单靶或双靶基因位点RNAi质粒载体的方法
目的 开发一种快速构建RNA干扰(RNAi)质粒载体的方法 .方法 以pBluescript Ⅱ质粒载体为母体,逆向导人人U6和H1启动子序列,仅用两条互补的寡核苷酸链,可快速构建单靶基因位点RNAi质粒载体;利用RNAi表达框两侧的Mun Ⅰ及EcoR Ⅰ酶切位点,将多个干扰表达框串联,可快速构建多靶基因位点RNAi质粒载体;根据以上原则,构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因和萤火虫荧光素酶(LUC)基因的单靶点及双靶点RNAi质粒载体,以检测其干扰效果.结果 构建的RNAi质粒载体可产生较理想的干扰效果,单靶点RNAi载体的干扰效率可达90%,双靶点RNAi载体的干扰效率可达87.5%.结论 该方法 可快速构建单靶点及双靶点的RNAi质粒载体,可在同一细胞内同时对多个靶基因实施有效的RNA干扰.
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质粒介导的NDRG2 shRNA抑制其在人肿瘤细胞HHCC中的表达
目的构建含有针对MDRG2的shRNA的质粒,抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达.方法用PCR方法从人基因组DNA中扩增出336bp的U6启动子,与29bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连.连接后的pSNAVU6质粒转染入HHCC细胞,检测它们对NDRG2表达的影响.结果pSNAVU6重组质粒能抑制NDRG2的表达.结论针对NDRG2的短的发夹RNA能抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达.
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含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6构建
目的 构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究.方法 质粒pDsRed2-N1 中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6,得到pDsRed2-SilencerU6质粒,利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞,荧光显微镜、FACS检测转染效率.结果 DsRed2蛋白编码基因序列BbsⅠ点突变正确,成功构建pDsRed2-SilencerU6载体,其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白,利用脂质体转染技术,转染效率达70.61%.结论 成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达,为今后开展RNA干扰研究提供了基础.
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构建并检测以人U6 snRNA为启动子的RNA干扰质粒载体
目的: 应用人U6启动子构建RNA干扰载体pUC19NU,具有新霉素抗性且能够在真核细胞中复制,成为基因功能和基因治疗研究等领域的RNAi技术的工具.方法: 通过PCR从人类基因组中得到人U6 snRNA启动子,并针对增强绿色荧光蛋白(EGFP)和p53蛋白的基因,分别设计了两段可以转录出短发夹环状RNA的DNA模板序列,连入pUC19中,构建出RNA干扰质粒pUC19NU,分别得到质粒载体pUC19NUE 和 pUC19NUP. 结果: 以EGFP 和p53为靶基因的干扰实验证明,两种质粒载体分别转染HeLa细胞和KMB-17细胞,两种蛋白的表达皆受到有效抑制.结论: 该质粒能够有效地干扰相应内源性和外源性靶基因的表达,可以用于RNAi技术的研究.
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短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰
背景与目的: RNA干扰是一种通过细胞内导入双链 RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前 RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法.本研究旨在利用 DNA载体在细胞内产生短发夹状 RNA( short hairpin RNAs,shRNA) ,通过这些 shRNA来诱导 RNA干扰( RNA interference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段.方法:利用双荧光素酶报告系统来检测 DNA载体在细胞内产生的 shRNA诱导 RNAi的效果.比较该载体产生的 shRNA在不同条件下的 RNA干扰效果.结果: DNA载体产生的 shRNA在人细胞能诱导 RNAi,序列特异地抑制基因表达.抑制效果与所选基因靶位点高度相关.结论: shRNA在人细胞能诱导 RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析.
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基于PCR的siRNA表达框的制备
目的改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用.方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板.选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH-SY5Y细胞48h后提取RNA进行RT-PCR,检测RNA干扰的效应.结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确.细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制.结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究.
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shRNA表达载体的构建及对HBV复制和表达的抑制
目的:构建shRNA的表达载体,检测针对乙型肝炎病毒(HBV)的shRNA的稳定表达质粒对HBV复制和表达的影响.方法:扩增U6启动子构建shRNA表达载体pU6.针对HBV基因组序列设计并化学合成双链核苷酸克隆到pU6载体得到质粒pU6B/HBVi,脂质体介导转染带有HBV基因组的2.2.15细胞,定量PCR和ELISA法检测pU6B/HBVi对HBV复制和表达的影响.结果:成功构建了shRNA的真核表达载体;针对HBV的pU6B/HBVi质粒对HBV的复制和表达有明显的抑制作用.结论:稳定表达shRNA的pU6B/HBVi质粒可以抑制HBV在2.2.15细胞中的复制和表达.
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乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选
目的:构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶(Hpa)特异性基因真核表达载体. 方法:分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa-shRNA双链,将两两随机间隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3 条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa-shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达. 结果:酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE-shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别. 结论: 构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA.
