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rAAV2-hGAD65重组载体的构建和功能检测
目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能.方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65).包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度.体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ-氨基丁酸(GABA)的含量.在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量.结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10~(11)/ml.组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L.STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g.结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体.AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能.在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量.
关键词： 谷氨酸脱羧酶2 腺相关病毒载体 基因克隆 反转录-聚合酶链式反应 人 -
脑摄取平衡时丙泊酚对犬脑不同区域GAT-1 mRNA和GAD65 mRNA的影响
目的 探讨不同剂量丙泊酚恒速静注50 min时对犬脑不同区域γ-氨基丁酸浆膜转运体1(GAT-1)及谷氨酸脱羧酶65(GAD65)mRNA的影响.方法 18只12～18月健康杂种犬,雌雄不限,体质量10～12 kg,随机分为对照组(C组)、低剂量组(L组)和高剂量组(H组),每组6只.L组和H组分别以丙泊酚5.5 mg/kg和7.0 mg/kg静脉注射,续以55 mg/(kg.h)和70 mg/(kg.h)恒速静脉输注50 min,分别取颈内动、静脉血各2ml后,快速静脉注射10％ KC1注射液2mg/kg处死；采用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)测动、静脉血浆丙泊酚浓度.C组不给予任何干预措施,快速静脉注射10％ KC1注射液2 mg/kg处死.3组均解剖获取下丘脑、底丘脑、背侧丘脑、海马、脑桥、顶叶、额叶组织,采用实时荧光定量PCR技术测脑组织中GAT-1 mRNA和GAD65mRNA的表达水平.结果 丙泊酚静脉输注50 min时,L组和H组丙泊酚血浆浓度(动脉-动脉,静脉-静脉比较)差异显著(P＜0.01),而两组颈内动脉和静脉丙泊酚血浆浓度比较差异均无统计学意义(P＞0.05).L组和H组下丘脑和海马GAT-1 mRNA的相对表达量均明显高于C组(P＜0.05,P＜0.01),两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；其他脑区GAT-1 mRNA的相对表达量3组均无显著差异.下丘脑和海马GAT-1 mRNA相对表达量的变化率,L组分别为(61.26±7.17)％和(79.34±39.95)％,差异无统计学意义(P＞0.05)；H组分别为(74.64±19.63)％和(97.12±32.31)％,差异无统计学意义(P＞0.05).背侧丘脑GAD65 mRNA的相对表达量,L组和H组均明显高于C组(P＜0.01)；其他脑区GAD65 mRNA的相对表达量3组均无显著差异.结论 丙泊酚恒速静注50 min,犬脑对丙泊酚的摄取处于平衡状态,此时,丙泊酚可明显上调下丘脑和海马GAT-1 mRNA以及背侧丘脑GAD65mRNA的表达,呈非剂量依赖性.
关键词： 丙泊酚 γ氨基丁酸浆膜转运体1 谷氨酸脱羧酶2 脑 犬
