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CKIp15INK4B相关新基因p15rs对HeLa细胞增殖影响的初探
目的探讨新克隆的CKIp15INK4B相关基因p15rs对细胞增殖的作用. 方法克隆p15rs编码区cDNA,通过基因转染技术将其导入HeLa细胞,检测细胞的生长曲线,细胞周期和集落形成能力. 结果构建了p15rs高表达的细胞模型HPS21,发现p15rs高表达可使HeLa细胞增殖被显著抑制,细胞生长速率下降,倍增时间延长,G1期细胞增加,S期细胞减少,集落形成能力下降. 结论新基因p15rs具有抑制癌细胞增殖和对细胞周期进程进行负调节的作用.
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半巢式甲基化特异性聚合酶链反应对肿瘤细胞株p15基因甲基化或缺失状态的检测
本研究分析多种恶性肿瘤细胞株的p15基因甲基化或缺失状态,阐明p15基因甲基化或缺失在肿瘤发生发展中的作用.运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应(hemi-nested methylation specific polymerase chain reaction,hn-MSP)分析20种恶性肿瘤细胞株和正常人单个核细胞或细胞株的p15基因甲基化及缺失状态,并评价该方法的敏感性和特异性.结果表明:在所有的细胞中,Molt-4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC-7221、NCI-H446细胞为部分甲基化,hn-MSP检测p15基因甲基化敏感性可达到1×10-5.正常人单个核细胞、HL-60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、U266、CEM细胞则为p15非甲基化,而K562、NB4、GMC、Jurkat似乎显现p15基因缺失或突变.结论:p15基因甲基化或缺失在多种肿瘤,特别在恶性血液病中有较高的发生率,且对疾病的进展及预后有密切的关系,hn-MSP具有较高的敏感性和特异性,值得在临床推广应用.
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亚砷酸诱导人食管癌细胞株EC109细胞p15INK4B基因的表达
目的:研究亚砷酸(As2O3)对人食管癌EC109细胞株细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15INK4B(p15)基因表达的影响.方法:终浓度2μmo1/L的As2O3加入食管癌EC109细胞系,采用甲基化特异PCR(MSP)检测食管癌EC109细胞系中p15基因甲基化,采用RT-PCR和Western blot方法检测As2O3处理前后p15的mRNA和蛋白质水平的表达情况.用Scion Image软件测量条带灰度值,P15蛋白与ACTB条带的灰度比进行半定量分析.结果:EC109细p15基因发生高甲基化,p15基因不表达.As2O3作用后p15基因甲基化程度明显下降,As2O3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(37.1 1±3.62,50.92±5.47,72.07±7.53vs97.23±9.80,P＜0.05).As2O3作用24 h后出现p15 mRNA表达,随As2O3作用时间延长p15 mRNA表达逐渐增强,各个时间组之间比较,除了未加药组和加药24 h组之间及加药24 h组和加药48h组之间差异无统计学意义外,其余各个时间组之间差异有统计学意义(0.72±0.07 vs 0.58±0.06 vs 0.48±0.07 vs 0.41±0.08,P＜0.05).As2O3作用24 h后P15蛋白出现表达,2μmo1/L作用24-72 h中P15蛋白条带灰度逐渐增强,As2O3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(0.51±0.02 vs0.21±0.01 vs 0.16±0.02 vs 0.06±0.01,P＜0.05),说明其表达随As2O3作用时间延长而逐渐增强.结论:As2O3可使食管癌EC109细胞p15基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制细胞周期进程.
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p15INK4B基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用
目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Western blot方法检测转染细胞的P15蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;E C109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P＜0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P＜0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs 35.5±2.4%,36.3±0.7%,P＜0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.
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体外试验诱导白血病细胞p15INK4B基因重新表达
目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶(CdR)与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丁酸钠(SB)联合诱导白血病细胞p15INK4B基因重新表达的可能性. 方法采用急性髓系白血病细胞系KG1a和2例原代培养白血病细胞为研究对象;限制性内切酶联合PCR技术检测p15INK4B 基因启动子区甲基化状态;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p15INK4B mRNA的表达;Western 免疫印迹法检测p15INK4B蛋白的表达.结果受检细胞p15INK4B基因启动子区呈高甲基化状态,mRNA及蛋白表达完全或部分缺失;CdR和SB可单独诱导p15INK4B mRNA及蛋白表达,且有剂量依赖性;低浓度CdR(0.5 μmol/L)联合SB(0.5 mmol/L)显著诱导p15INK4B表达,其作用高于单用高浓度CdR(1 μmol/L)或高浓度SB(1 mmol/L).结论 CdR和SB可诱导甲基化失活的白血病细胞p15INK4B 基因重新表达,二者有明显的协同作用.
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p15INK4B甲基化与骨髓增生异常综合征患者预后及地西他滨疗效的关系
目的 通过检测初诊骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15INK4B甲基化水平,观察地西他滨治疗前、后p15INK4B甲基化状态变化,探讨p15INK4B甲基化水平与预后的关系及其对地西他滨疗效的影响.方法 261例初诊MDS患者,其中男143例,女118例,中位年龄52(32 ～78)岁.低危组172例(低危104例、中危-1 68例),高危组89例(中危-2 52例、高危37例).收集患者骨髓单个核细胞,采用甲基化特异性PCR (MSP)检测p15INK4B甲基化水平,按p15INK4B甲基化程度对患者进行生存分析.采用MSP方法分别检测58例MDS患者地西他滨治疗前及治疗2个疗程后骨髓p15INK4B甲基化水平,分析p15INK4B甲基化对地西他滨疗效的影响.结果 低危组患者p15INK4B甲基化水平明显低于高危组患者(117.22对157.63,P＜0.05).p15INK4B甲基化阳性患者2年预期生存(OS)率低于阴性患者(69.8％对91.8％,P＜0.05);在低危组,p15INK4B甲基化阳性患者2年预期OS率低于阴性患者(78.2％对92.0％,P＜0.05);在高危组,p15INK4B甲基化阳性患者OS率及中位OS时间与阴性患者比较差异无统计学意义[35.6％对38.5％,(17.0±9.3)个月对(18.0±5.7)个月,P＞0.05].COX分析结果显示p15INK4B甲基化水平是OS时间的独立预后因素.治疗前p15INK4B甲基化阳性组患者地西他滨治疗的总反应率及完全缓解率与阴性组比较差异无统计学意义(65.9％对76.5％,22.0％对29.4％,P＞0.05).地西他滨治疗有效组p15INK4B甲基化水平在治疗前、后差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初诊时p15INK4B甲基化水平高的MDS患者生存时间更短,但p15INK4B甲基化水平对地西他滨疗效无明显影响.
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p15INK4B基因转染联合TGF-β1对人食管鳞癌的抑制作用
目的:探讨p15INK4B基因转染与TGF-β1联合应用对人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖和凋亡的影响.方法:脂质体介导将pCDNA3.1(+)-p15转染EC109细胞,稳定筛选后加入10ng/ml的TGF-β1.PCR检测外源p15基因,Western blot检测转染细胞P15蛋白的变化.用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测p15转染TGF-β1对EC109增殖和凋亡的影响.结果:联合应用与二者单独应用相比,明显抑制EC109生长速度,集落形成率显著降低(P＜0.01),发生G1/S阻滞,G1期比例显著升高(P＜0.05),S期比例明显降低(P＜0.05),凋亡率明显升高(P＜0.01).透射电镜发现二者联合应用诱导EC109发生明显的细胞凋亡.结论:p15基因转染与TGF-β1联合应用可以进一步增强对食管鳞癌EC109细胞的抑制作用并诱导其凋亡.
关键词： p15INK4B 基因转染 TGF-β1食管鳞癌 -
P15INK4B和P16INK4A基因在鼻咽癌组织中异常甲基化
目的 通过检测P15INK4B和P16INK4A基因启动子区甲基化情况,分析其与鼻咽癌发生发展及临床病理特征关系,探讨其可能在鼻咽癌临床早期分子生物学诊断和治疗中的作用.方法 运用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)对54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P15INK4B和P16INK4A基因启动子区甲基化状态进行检测.结果 鼻咽癌组织中P15INK4B和P16INK4A基因启动子区甲基化阳性率分别为22%(12/54)和46%(25/54),二者总检出率为48%(26/54),26例甲基化的癌组织同时出现二者甲基化为11例;而在正常鼻咽上皮组织中未检测到P15INK4B和P16INK4A基因启动子区甲基化.结论 P15INK4B和P16INK4A基因肩动子区甲基化与患者临床病理特征无明显相关关系,为鼻咽癌早期事件,有望成为早期分子生物学诊断的标志物,将来还可能作为去甲基化基因治疗的靶点.二者在鼻咽癌发生发展中可能存在协同作用.
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p15INK4B和p21WAF1基因对人胰腺癌细胞系BxPC3的协同抑制作用
目的 探讨p15INK4B(p15)和p21WAF1 (p21)基因联合转染对人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖和凋亡的影响.方法 脂质体介导将pcDNA3.1(+)-p15和pcDNA3.1(+)-p21转染BxPC3细胞,稳定筛选后用RT-PCR检测转染细胞p15和p21基因mRNA表达,Western blot检测转染细胞p15和p21蛋白的表达.用MTT法和透射电镜检测p15和p21基因分别及联合转染对BxPC3细胞增殖和凋亡的影响,流式细胞仪检测BxPC3细胞周期分布和凋亡率.结果 p15和p21转染组BxPC3细胞生长速度低于空载体组和未转染组,联合转染与二者单独转染相比,细胞体外生长速度受抑制更明显.p15和p21转染组BxPC3细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组,S期比例显著低于空载体组和未转染组,并出现凋亡峰,透射电镜亦发现p15和p21转染组发生细胞凋亡.p15和p21联合转染组与二者单独转染相比,发生更为明显G1/S阻滞,G1期比例升高,有统计学意义,S期比例降低,但无统计学意义,凋亡率升高,有统计学意义.透射电镜发现联合转染组诱导BxPC3发生更明显的细胞凋亡.结论 p15和p21基因联合转染可以进一步增强对人胰腺癌BxPC3细胞的抑制作用和诱导凋亡作用.
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地西他滨联合三氧化二砷对肝癌SMMC-7721细胞株P15INK4B及甲基化转移酶表达的影响
目的 探讨地西他滨(DAC)和三氧化二砷(As2O3)对肝癌SMMC-7721细胞株P15INK4B抑癌基因及甲基化转移酶表达的影响.方法 MTT方法检测地西他滨和三氧化二砷对SMMC-7721细胞株的抑制率.RT-PCR方法检测P15INK4B、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达.结果 2.0mmol/LDAC和2.0μmol/L As2O3联用,肝癌SMMC-7721细胞株细胞增殖抑制率均较4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As2O3单药组增强[(72h:(69.9±1.2)％比(33.8±0.7)％、(47.9±2.5)％,P<0.05)].地西他滨和As2O3作用细胞72h后P15INK4B抑癌基因表达增强,联合组同4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As2O3单药组比较,差异有统计学意义[(0.74±0.14)比(0.57±0.15)、(0.56±0.11),P<0.05];甲基化转移酶表达水平下调,联合组同4.0mmol/LDAC、4.0μmol/L As2O3单药组比较,差异有统计学意义[DNMT3A:(0.28±0.11)比(0.36±0.13)、(0.41±0.13),P<0.05;DNMT3B:(0.32±0.13)比(0.39±0.12)、(0.45±0.16),P<0.05;DNMT1:(0.31±0.15)比(0.44±0.19)、(0.44±0.12),P<0.05].结论 地西他滨和三氧化二砷可能通过抑制肝癌SMMC-7721细胞株甲基化转移酶,增加P15INK4B基因表达来抑制肝癌细胞增殖.
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鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因异常甲基化的研究
目的 通过检测P14肝和P15INK4B基因启动子区甲基化情况,分析其与鼻咽癌发生、发展及临床病理特征的关系,探讨其可能在鼻咽癌临床早期分子生物学诊断和治疗中的作用.方法 运用甲基化特异性聚合酶链式扩增对54例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽上皮组织的P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化状态进行检测,比较两者的差异,并分析鼻咽癌组织中两种基因甲基化与患者临床病理特征的关系,以及两种基因甲基化的相关性.结果 鼻咽癌组织中P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率分别为20.4%(11/54)和22.2%(12/54),两者总检出率为27.8%(15/54);而正常鼻咽上皮组织中未检测到P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化;两组间P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化阳性率差异有统计学意义(P<0.01).15例甲基化的癌组织同时两种基因同时甲基化为8例,非甲基化39例.P14ARF和P15INK4B基因甲基化与鼻咽癌的临床病理特征均无明显相关性(均P>0.05).结论 P14ARF和P15INK4B基因启动子区甲基化在鼻咽癌的发生、发展中可能存在协同作用,作为鼻咽癌发生的早期事件,有望成为分子生物学早期诊断的标志物,将来还可能作为去甲基化基因治疗的靶点.
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骨髓增生异常综合征的免疫表型和SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因表达
目的 探讨骨髓增生异常综合征(MDS)特征性免疫表型,SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因表达程度,及其与临床病情进展的关系.方法 抽取50例MDS患者骨髓细胞,用流式细胞学技术检测免疫表型；抽取单个核细胞,用RT-PCR方法检测SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表达程度.结果 与对照组相比,MDS患者骨髓细胞原始群CD7和CD34表达增多；粒细胞群CD34表达增多,CD13、CD33、CD11b表达下降；单核细胞表达CD117和CD34.与对照组相比,MDS患者骨髓单个核细胞SURVIVIN和TRF1基因mRNA表达增加,P15INK4B基因mRNA表达下降(P均＜0.05).从低危组到高危组,SURVIVIN和TRF1基因mRNA表达增加,P15INK4B基因mRNA表达下降(P均＜0.05).结论 MDS免疫表型有其特征性,SURVIVIN、P15INK4B和TRF1基因表达可能与其发病进展有关.
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骨髓增生异常综合征患者p15INK4B基因甲基化状态的研究
目的:检测骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者抑癌基因p15INK4B启动子区异常甲基化情况及其mRNA表达水平,探讨p15INK4B基因异常甲基化在MDS发生、发展中的作用.方法:应用甲基化特异性PCR检测32例MDS患者骨髓p15INK4B基因启动子区甲基化状态,逆转录PCR(RT-PCR)检测p15 mRNA表达情况.结果:32例MDS患者骨髓有14例检测到p15INK4B基因启动子甲基化(甲基化阳性率为43.8%),且多为高危型患者.MDS患者骨髓p15 mRNA表达水平明显降低.MDS患者p15INK4B基因启动子甲基化与p15mRNA表达缺失具有明显的相关性.结论:MDS中p15INK4B基因启动子高甲基化与基因表达失活密切相关,并在MDS的发生、发展中有重要作用.
