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先天性肠无神经节细胞症患儿中血清维生素A及肠组织维甲酸受体α和HA117的表达特点
目的 检测先天性肠无神经节细胞症(HD)患儿中血清维生素A及肠组织维甲酸受体α(RARα)、抗分化长链非编码RNA(LncRNA) HA117的表达特点,探讨其与HD发病机制的可能联系.方法 收取17例临床诊断为HD的患儿术前外周血及手术结肠组织标本,结肠组织由近端至远端分为3组:吻合口组、扩张段组和痉挛段组.检测血清维生素A浓度,采用Real-time PCR、免疫组织化学染色、Western blotting方法检测RARα及HA117在各组结肠组织的表达水平.结果 17例HD患儿均有不同程度维生素A缺乏,血清维生素A平均浓度为(0.73±0.05) μmol/L.在吻合口段,RARα在肌间神经丛可见棕黄色的阳性染色,而在痉挛段几乎未见阳性神经丛染色;在吻合口组、扩张段组和痉挛段组,RARα mRNA相对表达量依次为3.62±1.12、1.81±0.69、0.65±0.32,与吻合口相比,痉挛段表达量降低(P＜0.05,n=17);HA117mRNA相对表达量依次为0.47±0.15、1.25±0.40、2.57±0.70,与吻合口相比,痉挛段表达量增高(P ＜0.001,n=17);RARα蛋白相对表达量依次为1.16±0.05、0.99±0.05、0.88±0.04,与吻合口相比,扩张段及痉挛段表达量降低(分别为P＜0.05、P＜0.001,n=17).结论 维生素A、RARα及HA117可能共同参与肠神经系统(ENS)的发育过程;其中,维生素A和RARα可能促进了ENS的正常分化发育,而高表达的HA117可能对抗了前者的促分化作用,阻碍了ENS正常分化发育过程,进而导致HD的发生.
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新基因HA117在淋巴瘤细胞中的耐药相关功能研究
目的:研究新基因HA117对淋巴瘤细胞系Raji细胞耐药性的影响,探讨新基因HA117与多药耐药(multi-drug resis-tance,MDR)的相关功能.方法:以重组质粒pAdtrack-HA117转染Raji细胞,得到高表达HA117的Raji/HA117细胞;以HA117靶向RNA干扰重组质粒pSES-HUS-HAi转染Raji/HA117细胞,得到外源性HA117基因表达沉默的Raji/HA117/HAi细胞;以荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率,RT-PCR 检测转染前后HA117基因的表达,MTT检测比较高表达HA117基因的Raji/HA117细胞以及RNAi沉默HA117基因表达前后Raji细胞的药物敏感性变化.结果:脂质体介导pAdtrack-HA117转染Raji细胞后,实验细胞有效表达HA117,高表达HA117的Raji/HA117细胞对柔红霉素(daunorubicin,DNR)、阿霉素(adriamycin,ADM)、长春新碱(vincristine,VCR)、环磷酰胺(cytophosphan,CTX)和5氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的耐药性比未转染组Raji细胞增强2～7倍(P＜0.05);转染PSES-HUS-HAi可有效沉默Raji/HA117细胞中高表达的HA117基因,与未转染组Raji细胞相比,Raji/HA117/HAi细胞对DNR、ADM、CTX、VCR和5-FU的耐药性消失(P＞0.05).结论:新基因HA117可使Raji细胞对多种化疗药物的耐药性增强,提示新基因HA117可能具有多药耐药相关功能,有望成为新的肿瘤基因治疗靶点.
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新耐药基因HA117在神经母细胞瘤中的表达及临床意义
全反式维甲酸(ATRA)是我国学者首先使用的白血病化疗药物及实体瘤辅助化疗药物[1].在肯定ATRA对恶性肿瘤的疗效时,ATRA在使用后存在诱导肿瘤多药耐药的现象也同样受到广泛的关注[2-3].本课题组在建立HL-60/ATRA耐药株的基础上成功筛选并发现一未知的耐药新基因,并命名为HA117(Genebank Number:CB214920).
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新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备HA117多克隆抗体.方法 以HA117表达质粒pAdTrack-HA117为模板,PCR扩增HA117基因,扩增产物转入BL21(DE3)感受态细胞,进行HA117蛋白诱导表达,采用SDS-PAGE检测表达产物.纯化HA117蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.通过间接ELISA检测其效价.将转染携带HA117重组腺病毒的HEK293细胞为实验组,未转染的HEK293细胞为对照组,用细胞免疫荧光和Western blot方法 检测其过表达的HA117蛋白,验证制备的HA117多克隆抗体的特异性.结果 成功获得HA117多克隆抗体,间接ELISA法检测显示抗HA117血清效价为1∶729 000.细胞免疫荧光和Western blot检测示制备的HA117多克隆抗体可以特异性识别HA117抗原蛋白.结论 获得了效价和特异性较高的HA117多克隆抗体.
