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淡色库蚊(Culex pipiens Pallens)与击倒抗性(kdr)相关的钠通道基因突变
本研究采用RT-PCR技术,使用简并引物分别从淡色库蚊(Culex pipiens pallens)敏感品系和抗溴氰菊酯品系中扩增出钠通道ⅡS4～ⅡS6区域的基因片段,长度为359bp.该基因片段所编码的氨基酸与黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)、家蝇(Musca domestica)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)及德国小蠊(Blattella germanica)等昆虫相应区域的氨基酸序列具有较高的同源性,其同源性分别为95.8%,95.0%,100.0%,98.3%和95.0%.经序列比对,确认抗溴氰菊酯品系淡色库蚊钠通道基因在1014位点发生了突变:该位点的碱基"A"突变为"T",其对应氨基酸由亮氨酸(L)变为苯丙氨酸(F),该突变(L1014F型)在多种昆虫中较为常见.
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荧光定量PCR快速检测淡色库蚊击倒抗性相关钠通道基因突变(L1014F)
本研究的目的是采用荧光定量PCR扩增技术,建立快速检测淡色库蚊Culex pipiens pallens钠离子通道L1014位点击倒抗性(Knockdown resistance,kdr)相关点突变方法,该方法的原理是以突变位点为3′端设计两条特异性上游引物,和一条非特异下游引物组成两对引物平行双管法,用荧光定量PCR扩增快速检测淡色库蚊钠通道L1014F突变的SS,SR,RR 3种基因型.用此方法对48个北京淡色库蚊样本进行基因分型,42个样本检测结果与等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测结果完全一致,得到SS(TTA/TTA)基因型21个,占50.0%,SR(TTA/TTT)基因型16个,占38.1%,RR(TTT/TTT)基因型5个,占11.9%,与测序结果完全一致;另外6个样本检测结果与AS-PCR检测结果不一致,测序显示:TCA(L1014S)、TTC(L1014F)突变各1株,另4株为敏感纯合子.因此,PCR SYBR GREEN 扩增灵敏度(93.75%)低于AS-PCR法(100%),但特异性较高,达100%;分析原因可能是被检测样本引物结合部位多态性较高,影响了引物的结合,而AS-PCR凭经验能完成部分结果的判断.综上所述,用PCR SYBR GREEN 扩增技术快速检测淡色库蚊的L1014F基因突变仍是一种值得采纳的等位基因分型方法.
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北京地区德国小蠊(Blattela germanica)对氯菊酯抗性相关的钠通道基因点突变的研究
应用RT-PCR扩增技术,克隆了北京地区自然种群德国小蠊(Blattela germanica)的钠离子通道基因片段,片段长度为162bp,并对其进行了测序.将推导的氨基酸序列与德国小蠊敏感品系的相应序列进行比较,发现在钠离子通道ⅡS4-ⅡS6的993同源位点上存在ku(TTG)→Phe(TTC)突变,表明该品系的抗药性可能与击倒抗性(knockdown resistance,kdr)有关.
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云南及河南省部分地区中华按蚊对溴氰菊酯抗性及kdr突变频率调查
目的 了解云南及河南省部分地区中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗药性状况及该抗性与击倒抗性基因型的关联性.方法 2010年7-8月采集云南省勐腊和元阳县,河南省桐柏、淮滨县以及永城市中华按蚊样本,F1代成蚊用接触筒内成蚊药膜滤纸接触法,按照WHO区分剂量,调查5个地区中华按蚊对溴氰菊酯的抗药性状况,并以PCR产物直接测序法抽取部分样本对kdr相关钠离子通道1014位点的基因型进行检测.结果 5个地区中华按蚊溴氰菊酯区分剂量死亡率均＜98％,其中淮滨县、永城市、桐柏和元阳县中华按蚊的死亡率均＜80％,为抗性群体；勐腊县中华按蚊为初步抗性群体.PCR产物测序结果显示,河南省淮滨县、永城市和桐柏县中华按蚊样本中均发现kdr位点突变,云南省元阳和勐腊县中华按蚊样本中未发现kdr位点突变.结论 河南省永城市和桐柏县的溴氰菊酯抗性与kdr位点突变相关；淮滨县中华按蚊kdr突变率高,但未发现其与溴氰菊酯抗性的关联.
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溴氰菊酯对德国小蠊滞留喷洒药效与kdr突变关系研究
目的 明确现场种群德国小蠊对溴氰菊酯抗性状态,研究其滞留喷洒的杀蟑效果,以及耐受个体kdr抗性基因型.方法 根据相关国标用药膜法检测试虫对溴氰菊酯抗性,用强迫接触法测定在玻璃、清漆木板及水泥3种代表性表面滞留喷洒药效,用钠离子通道基因DNA扩增产物测序确定基因型.结果 随着表面吸水性增强,对试虫击倒速度降低,持效期缩短；不同种群的抗性状态影响药效,3种表面对敏感及低抗(2.05倍)种群均有较好效果,对中抗(5.17倍)种群效果较差.对杀虫剂耐受的个体均携带kdr抗性基因型,中抗种群中抗性纯合(RR)基因型频率较高,而低抗种群中抗性杂合(RS)基因型频率较高.结论 滞留喷洒防治中,德国小蠊对杀虫剂抗性表型与其携带的抗性基因型密切相关,不恰当的防治反而增加种群中抗性基因频率,因此要根据环境类型、靶标抗性状态与用药史,调整施药次数与剂量,并将滞留喷洒与胶、毒饵等手段结合,从而达到理想的防治效果.
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中华按蚊溴氰菊酯处理后存活与死亡群体击倒抗性突变型差异比较
目的 探讨溴氰菊酯抗性中华按蚊群体不同抗性突变类型对蚊虫抗性的影响.方法 对2011及2012年合肥市6个调查点中华按蚊采用WHO接触筒法进行溴氰菊酯敏感性测试,留存抗性测试后存活与死亡中华按蚊标本,两种群体各随机选取80只标本,实验室提取基因组进行钠离子通道蛋白扩增并双向测序,两群体间突变类型比较采用SPSS软件进行x2检验.结果 测序发现两种群体均存在2种突变类型,即由TTG向TTT及TGT突变.对测序图进行比对发现存在4种突变组合,即TTG(T)杂合、TTT纯合、TG(T)G(T)杂合和TG(T)T杂合.对两种群体TTG、TTT及TGT 3种单倍型构成进行比较,x2=17.571,P＜0.01,存活群体TGT单倍型构成(36.9％)高于死亡群体(19.4％).结论 TGT抗性突变类型对溴氰菊酯抗性的效应高于TTT突变.
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钠离子通道与拟除虫菊酯击倒抗性的研究进展
拟除虫菊酯类杀虫剂具有高效低毒低残留性,现已占有全球超过25%的杀虫剂市场,广泛用于农业和卫生害虫的防制.然而20多年来的持续应用,导致很多昆虫都对之产生了抗药性,从而减损了这种杀虫剂持续有效的应用[1].神经生理学研究表明,DDT和拟除虫菊酯的作用机制是干扰电位依赖的Na+通道闸门开闭的动力学,使得Na+通道延迟关闭,引起重复后放(repetitive after discharge)和突触传递的阻断[2-3].昆虫神经系统对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性下降主要与神经细胞膜上Na+通道的敏感性降低有关.现介绍近年来对Na+通道与拟除虫菊酯击倒抗性的研究进展.
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德国小蠊钠离子通道抗性研究进展
德国小蠊在医学与经济方面的重要性和危害性促使人们对其进行广泛的化学防治,但随之产生严重的抗性.该文以德国小蠊钠离子通道抗性即击倒抗性(knockdown resistance,kdr)为主题,重点论述了德国小蠊kdr抗性的发现历史、分子与进化机制,扼要介绍了钠离子通道结构特征、kdr突变的功能研究方法以及近期所取得的代表性研究结果.此外,概述了该领域的新研究方向及结果对德国小蠊防制、抗性监测与治理等的理论与指导意义.
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特异性等位基因PCR扩增技术检测家蝇击倒抗性相关钠通道的基因突变
城市家蝇(Musca domestica)的化学防制多以混配或复配拟除虫菊酯类杀虫剂为主,近10年来国内各城市均有家蝇对拟除虫菊酯产生抗药性的报道[1-5].昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性主要是击倒抗性(knockdown resistance,kdr),Farnham发现kdr在家蝇对拟除虫菊酯的抗性中具有重要作用.拟除虫菊酯的作用靶标主要是昆虫神经细胞膜上的钠离子通道[6,7],通过比较敏感、抗性及高抗性家蝇的部分及全部钠通道基因序列,发现para型钠通道Vssc1基因的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即CTT→TTT的突变和击倒抗性相关[8-10].
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云南省三带喙库蚊对DDT和溴氰菊酯抗性群体的击倒抗性基因突变分析
目的 分析经接触DDT和溴氰菊酯敏感性测定的三带喙库蚊(Culextritae niorh ynch us)的抗性(存活)与敏感(死亡)表型样本的击倒抗性基因(knockdown resistance,kdr)序列,阐明其抗性表型与kdr基因突变的关系. 方法 收集云南昭阳、芒市、江城和孟连等地的三带喙库蚊经接触DDT和溴氰菊酯测定后死亡和存活的个体,分别提取单蚊基因组DNA,PCR扩增kdr部分基因片段,测定和分析序列,统计抗性与敏感表型个体中kdr突变的基因型和频率,采用x2检验分析kdr基因突变与抗性表型的相互关系. 结果 共获得411条三带喙库蚊kdr基因序列,检测结果显示,在1014位点存在突变,等位基因有2种,即野生型TTA/L和突变型TTT/F;基因型共3种,分别为野生型纯合子L/L,突变型纯合子F/F,以及野生型/突变型杂合子L/F,频率分别为96.35％ (396/411)、0.73％ (3/411)和2.92％(12/411).在接触DDT的抗性与敏感表型个体中,突变基因型频率分别为3.42％(4/117)和3.88％ (4/103);在接触溴氰菊酯的抗性与敏感个体中,突变基因型频率为3.96％(4/101)和3.33％ (3/90).接触DDT和溴氰菊酯的三带喙库蚊抗性与敏感表型与kdr基因型频率无相关性(x2=0.034,P＞0.05;x2=0.053,P＞ 0.05). 结论 云南省三带喙库蚊中发现kdr新的等位基因L1014F,但频率较低.该蚊对DDT和溴氰菊酯产生抗性与kdr基因突变未见相关性.
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中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性及kdr突变
目的 了解江苏省洪泽湖地区疟疾媒介中华按蚊对菊酯类杀虫剂的抗性状况及钠离子通道部分位点突变情况.方法 2012-2013年8-9月,沿洪泽湖周边采集淮安、洪泽、泗洪、盱眙、泗阳等地区中华按蚊成蚊样本,圆球法检测击倒中时间(KT50).多重PCR法检测钠离子通道1014位点kdr基因突变情况.结果 5个地区采集的按蚊均为中华按蚊,中华按蚊成蚊对氯菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯3种杀虫剂的平均KT50分别为16.92、16.53、22.98 min,抗性倍数为4.61、5.45和4.60,均为抗性种群.部分kdr基因发生突变,存在L1014C和L1014F两种突变类型,7种基因型(TTG/TTG,TTG/TTT,TTG/TTC,TTG/TTG,TTT/TTT,TTT/TTC,TGT/TGT)主要突变类型为TTT(或TTD),突变频率为72％～87％,其次为TGT突变12％～21％,敏感的TTG较少.结论 该地区中华按蚊对3种菊酯类杀虫剂产生一定的抗性,钠离子通道kdr基因L1014位点出现高频率的突变,突变类型主要为TTT和TGT,提示该地区中华按蚊成蚊防治需根据抗性监测结果加强抗性治理.
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西藏墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变
目的 探明西藏林芝地区疟疾流行区墨脱县多斑按蚊复合体是否发生击倒抗性突变,并获得我国多斑按蚊复合体5成员种钠离通道蛋白基因(VGSC)ⅡS4-S6区段基因序列信息.方法 采用简并引物扩增我国多斑按蚊复合体5成员种的VGSC基因ⅡS4-S6区段,扩增产物双向测序拼接；PCR扩增墨脱县背崩乡、德兴乡、墨脱镇和达木乡捕获的共161只多斑按蚊复合体VGSC基因,对PCR产物双向测序,观察L1014位点是否发生突变.结果 获得我国多斑按蚊复合体5成员种VGSC基因ⅡS4-S6区段基因序列,5成员种L1014位点均为TTA,对墨脱县的背崩乡、墨脱镇和达木乡捕获的伪威氏按蚊和威氏按蚊进行VGSC扩增并测序,均未发生击倒抗性突变.结论 西藏林芝地区墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变.
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中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立
目的 建立可靠的中华按蚊拟除虫菊酯击倒抗性的PCR检测方法.方法 基于课题组前期研究发现的拟除虫菊酯抗性中华按蚊钠离子通道蛋白(VGSC) L1014位点的突变机制,即TTG突变为TTT和TGT,设计特异AS-PCR引物,进行中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性突变检测.结果 设计的AS-PCR引物和建立的反应体系可以分别扩增出现已发现的中华按蚊击倒抗性的TTG(T)杂合、TTT纯合、TG(T)G(T)杂合、TG(T)T杂合,PCR电泳图结果与测序图结果一致.结论成功建立中华按蚊击倒抗性突变的PCR检测方法,可用于现场中华按蚊的击倒抗性检测.
