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小鼠Trim30α人同源基因的生物信息学筛选及初步鉴定
目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.构建Trim22的真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测Trim22对TAB2诱导的NF- κB报告基因活化的影响.结果 Trim30α与人Trim5α.、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％；Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化,而Trim5α无显著抑制作用.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.
关键词： 三基序蛋白22 核因子κB 生物信息学 双萤光素酶报告基因系统 -
小鼠Trim30α的人同源基因的生物信息学筛选及生物学功能的初步鉴定
目的 通过生物信息学方法寻找小鼠Trim30α的人同源基因,观察候选人Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 用MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子进行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选人Trim与小鼠Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.以筛选出小鼠Trim30α的人同源基因,并将其构建成真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测其对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化的影响.结果 生物信息学分析显示Trim30α与人Trim5α、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％；Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.
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Trim22B细胞表位预测及多克隆抗体制备与鉴定
目的:预测人Trim22的B细胞抗原表位,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:利用生物信息学软件分析Trim22的氨基酸序列,确定抗原表位并人工合成多肽.将合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫大白兔制备抗Trim22的抗体.经饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并对抗体进行ELISA、Western blot鉴定.结果:获得抗Trim22的多克隆抗体,抗体效价为1∶16 000,该抗体能特异性地识别包含(382～397)区段的Trim22缺失突变体,同时该抗体不能识别Trim22旁系同源分子Trim5α、Trim6和Trim34α.结论:采用人工合成多肽作为半抗原制备出抗Trim22的多克隆抗体,对研究内源性Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用机制具有重要价值.
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HIV结构蛋白p24与三基序蛋白22胞内定位及出胞研究
比较p24-DsRed1、p24-DsRed2、p24-DsRed-Monomer三种荧光蛋白的表达强弱,观察p24-DsRed1与TRIM22-EGFP结合物在细胞中的分布特点.构建pDsRed1-N1-p24及pDsRed2-N1-p24真核表达载体,转染HEK293T细胞,经荧光显微镜比较三种p24-DsRed荧光偶联蛋白的表达强度.选择荧光强度强的pDsRed1-N1-p24与pEGFP-N3-TRIM22共转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察两者结合物在细胞中的分布特点.结果显示,经荧光显微镜检测,转染48 h后红色荧光蛋白强度由大到小依次为p24-DsRed1、p24-DsRed2、p24-DsRedm.在HEK293T细胞中共转染p24-DsRed1和TRIM22-EGFP,发现两者存在共定位关系,有意思的是两者的结合体能以出胞形式脱离细胞.结果表明,p24-DsRed1荧光蛋白强度显著高于p24-DsRed2和p24-DsRedm,TRIM22-p24结合物能以出芽形式脱离细胞.
关键词： HIV衣壳蛋白p24 三基序蛋白22 DsRed 出芽 -
TRIM22靶向调控eIF4E在NB4细胞粒系定向分化过程中的作用与机制
目的 探讨在人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞粒系分化过程中三基序蛋白22(TRIM22)的功能及其与真核细胞起始因子4E(eIF4E)的相互作用,从而进一步阐明TRIM22靶向调控eIF4E的机制.方法 体外实验建立NB4细胞诱导分化模型,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及Western blotting技术检测TRIM22、eIF4E基因和蛋白表达的变化,并通过电穿孔转染技术敲低或过表达TRIM22后利用CCK-8和流式细胞术检测其对细胞功能的影响,及对eIF4E蛋白表达水平的影响,后利用免疫共沉淀(CO-IP)实验验证TRIM22与eIF4E的相互作用.结果 全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞后,TRIM22的mRNA相对表达量由1.01±0.15逐渐升高到30.98±2.79(F=280.700,P=0.000),蛋白相对表达水平由0.22±0.03逐渐升高至0.51±0.05(F=51.430,P=0.000).反之,eIF4E的mRNA相对表达量由1.01±0.09逐渐降低至0.47±0.06(F=20.520,P=0.000),蛋白相对表达水平由0.97±0.02逐渐降低至0.64±0.09(F=14.700,P=0.001).流式细胞术检测TRIM22过表达后ATRA干预组PE-CD11b表达水平[(78.80±2.00)%]比空载体ATRA干预组[(58.70±2.70)%]和共转染后ATRA干预组[(61.60±3.80)%]均升高(t=9.535,P=0.000;t=8.187,P=0.000).同时,过表达TRIM22基因水平后,eIF4E蛋白水平会反向变化(t=4.985,P=0.007).CO-IP实验验证TRIM22通过结合eIF4E而起作用.结论 TRIM22在NB4细胞粒系定向分化过程中促进细胞分化,并且可通过靶向结合eIF4E抑制其表达而发挥重要作用.
关键词： 白血病 细胞分化 真核细胞起始因子4E 三基序蛋白22 -
pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体的构建及在HEK293T细胞中的表达
目的 构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点.方法 用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定.将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪、荧光显微镜观察TRIM22-EGFP的表达;通过激光共聚焦,经LysoTracker DeepRed及DAPI分别染色溶酶体及细胞核,观察TRIM22-EGFP在293T细胞的分布特点.结果 经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体.流式细胞仪检测发现,转染细胞中TRIM22-EGFP+细胞约70％左右.荧光显微镜检测发现,TRIM22-EGFP在293T细胞中能以弥散、小斑点或大颗粒团块3种形式存在.激光共聚焦检测发现,在不同的293T细胞中TRIM22-EGFP可分别优势表达于细胞核、细胞浆,或者在胞核及胞浆均有大量表达.结论 TRIM22-EGFP能以弥散、小斑点或大颗粒团块形式分布于细胞核或细胞浆中.
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Trim22缺失突变体真核表达载体的构建
目的:构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础.方法:以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞巾表达.结论:成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础.
