首页 > 文献资料
-
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白抑制狼疮肾炎患者外周血单个核细胞B7分子表达及抗体产生
目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA-4Ig)对活动期狼疮肾炎(LN)患者外周血单个核细胞(PBMC)细胞表面B7-1(CD80)和B7-2(CD86)表达的影响及其对抗双链DNA(dsDNA)抗体和免疫球蛋白产生的影响.方法 将18例活动期LN患者的抗凝血标本随机分为LN的CTLA-4Ig处理组(LN-T组9例)和普通培养组(LN-NC组9例).另以14例正常人的抗凝血标本为对照,随机分为正常人的CTLA-4Ig处理组(NC-T组7例)和普通培养组(NC-NC组7例).用密度梯度离心法分离PBMC.处理组加入CTLA-4Ig(10 ng/L)、普通培养组加入等量普通培养基37℃孵育72 h后,采用流式细胞仪技术检测PBMC细胞表面B7-1和B7-2分子的表达;ELISA法检测孵育液中抗dsDNA抗体、IgG及IgM水平.结果 活动期LN患者CTLA-4Ig处理组与普通培养组比较,PBMC表面B7-2分子表达明显下降(P＜0.01);B7-1分子表达无显著变化(P＞0.05);孵育液中抗dsD-NA抗体、IgG及IgM的生成均明显减少(P＜0.01).而正常人的两组间各指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 CTLA-4Ig可抑制活动期LN患者的PBMC表面B7-2分子的表达,并可减少其抗dsDNA抗体、IgG及IgM的分泌.
关键词： T淋巴细胞 细胞毒性 融合蛋白质类 狼疮肾炎 B7-1(CD80) B7-2(CD86) -
融合蛋白Epo-Tpo(C)的表达及初步活性检测
目的进一步研究促血小板生成素Tpo的功能，探讨新型Epo的可能性。方法构建了融合蛋白Epo-Tpo(C)的真核表达载体，在CHO细胞中表达融合蛋白，染料亲合柱Blue-SepharoseCL-6B初步纯化，网织红细胞计数法体内测活并测定了体内半衰期和融合蛋白对大鼠肾衰模型的疗效。结果初步纯化的融合蛋白体内活性比ELISA结果高20％，半衰期为12 h，比标准Epo长近50％，对大鼠肾衰模型有良好的疗效。结论 Tpo富糖基化的C端结构域能显著延长Epo的半衰期，融合蛋白Epo-Tpo(C)具有一定的应用价值。
-
染色体和融合基因检测在异基因造血干细胞移植中的应用
现将我们在造血干细胞移植(HSCT)治疗白血病21例中应用染色体核型分析和筑巢式逆转录多聚合酶反应(nested-RT-PCR)检测融合基因的情况报道如下.
关键词： 白血病/遗传学 白血病/治疗 造血干细胞移植 融合蛋白质类 bcr-abl/分析 -
用COLD-PCR方法提高BCR-ABL1激酶区耐药突变检测灵敏度
目的 探讨用低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)方法提高BCR-ABL1融合基因激酶区耐药突变检测灵敏度的可行性.方法 本研究为实验诊断研究.设计常规巢式PCR(CN-PCR)和COLD-PCR方案扩增BCR-ABL1激酶区全长,扩增产物纯化后用Sanger测序法检测激酶区突变(KDM).采集32例经伊马替尼(IM)治疗并出现耐药的慢性粒细胞性白血病(CML)患者和20例初诊CML患者外周血或骨髓标本,用上述2种方案检测标本中的KDM.用PCR扩增和基因克隆方法鉴定患者标本中KDM所占比例.制备含不同KDM比例的标准品,对比分析2种方法的检测灵敏度.结果 32例IM耐药患者中,共检出15种KDM.其中用CN-PCR方法检出23例(71.9％) KDM阳性,用COLD-PCR检出28例(87.5％) KDM阳性.在20例初诊CML患者中,用CN-PCR未检出KDM,用COLD-PCR方法检出1例有p.E459K突变,突变型基因比例为3.5％.对于16种不同类型的KDM,COLD-PCR方法可提高检测灵敏度4～12倍.结论 用COLD-PCR方法可有效提高BCR-ABL1激酶区耐药突变的检测灵敏度,有助于早期发现耐药突变.
-
PCR-RFLP联合AS-PCR检测bcr/abl融合基因T315I突变方法的建立
目的 建立聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)联合等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)检测bcr/abl融合基因T315I点突变的方法,以提高bcr/abl基因T315I突变检出率.方法 方法学建立.构建abl基因野生型和T315I突变型重组质粒作为检测对象,设计一对野生型和突变型abl基因序列的通用引物,分别以野生型和T315I突变型质粒作为模板,PCR扩增出目的片段,经酶切初筛检测abl基因T315I突变情况,另设计一对仅针对T315I突变的特异性引物进行AS-PCR检测.并对具有该基因突变的1例慢性粒细胞白血病患者进行检测,同时对该方法的灵敏度和特异性进行检测.结果 PCR扩增的目的片段(273 bp)经限制性内切酶Dde Ⅰ酶切后,野生型abl基因片段产生141、68、46和18 bp4条片段,而T315I突变型abl基因片段酶切后产生159、68和46 bp3条片段.PCR-RFLP方法可以检测T315I突变,检测灵敏度为6％.再以酶切产物作为模板进行AS-PCR,优化反应条件,AS-PCR所能检测到的T315I低突变浓度为0.18％.所测临床标本结果显示,该患者发生了bcr/abl融合基因T315I突变.结论 PCR-RFLP联合AS-PCR检测方法特异性好、灵敏度高,能够给临床检测abl基因T315I突变提供一种新型的检测方法.
-
慢性髓细胞白血病BCR/ABL1突变克隆演化和治疗策略
伊马替尼的应用使很多慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者获得了长期生存,但是CML的BCR-ABL1融合基因激酶区突变(kinase domain mutation,KDM)会造成耐药.KDM有多种类型,不同类型是随机出现的.带有不同KDM特征的白血病克隆有一定的演变规律.在伊马替尼用药期间,耐药程度较高的突变细胞容易发展为优势克隆.建议在治疗伊马替尼耐药的CML时,除了努力发展下一代酪氨酸激酶抑制剂以外,还可考虑用传统药物来辅助治疗.
-
成人Ph+急性淋巴细胞白血病不同BCR-ABL转录本特征及预后比较
目的 比较成人Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)不同融合基因转录本临床特征的差异,并探讨其与预后的关系.方法 回顾性分析1996年1月至2007年12月我院诊断为Ph+ALL患者(年龄≥15岁)的资料,比较两个BCR-ABL转录本组间的临床特征,探讨两组患者预后的差异.结果 (1)106例患者中位年龄34岁,中位白细胞数28.5×109/L.p190组67例,p210组35例,p210组较p190组中位年龄偏大(40岁、31岁,P=0.002),初诊血小板数高(49.5×109/L、31.5×109/L,P=0.012),中、重度脾大的发生率高(48.6%、25.4%,P=0.019).(2)两组患者完全缓解(CR)率分别为92.2%(59/64)和93.9%(31/33).(3)p190组中位总生存(OS)和中位无复发生存(RFS)分别为13个月和10个月;p210组中位OS和RFS分别为15个月和10个月.两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 成人Ph+ALL中BCR-ABL以p190表达为主;p210患者较p190具有年龄偏大,初诊血小板数偏高,中、重度脾大发生率高的特点;两组在CR率、RFS和OS上无明显差异.
-
甲磺酸伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病54例近期疗效观察
目的观察甲磺酸伊马替尼(imatinib)治疗慢性粒细胞白血病(CML)的近期疗效.方法 54例CML患者接受imatinib治疗,其中慢性期(CP)17例,加速期(AP)13例,急变期(BC)24例.imatinib用法:CP患者400 mg/d,AP和BC患者600 mg/d,均为餐后一次顿服.治疗前全面查体,查血象、骨髓象、Ph染色体和(或)bcr/abl融合基因.治疗期间第1个月每周查血象2次,1个月后每周或2周1次.每2～4周查一次肝、肾功能.待血液学取得完全缓解(CR)后择期复查骨髓、Ph染色体和(或)bcr/abl基因.根据血象和患者对药物耐受情况及时调整药物剂量.结果经中位时间5个月(1～10个月)随访,17例CML CP期患者16例(94.1%)取得血液学CR,其中6例(35.2%)Ph染色体转阴;13例AP患者8例(61.5%)回到CP;24例BC患者9例(37.5%)回到CP.药物不良反应有造血功能抑制、眶周和下肢轻度水肿、全身肌肉关节酸痛和恶心、呕吐、低热(37.5～38℃)、皮疹、胆红素升高等.结论 imatinib对CML有较好近期疗效,其疗效以CP好,AP其次,BC较差.远期疗效有待进一步观察.药物不良反应可以耐受.
-
重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白对人膀胱癌细胞生长的抑制作用
目的探讨重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TP40)对膀胱癌细胞生长的抑制作用.方法采用蛋白印迹(Western blot)法检测人膀胱癌T24细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达.用浓度为5～1 000 μg/L的TP40处理T24细胞,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞生长24、48、72和96 h时的生长情况.氚-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入法检测TP40对T24细胞蛋白质合成的抑制作用.用浓度为1～7 500 μg/L的表皮生长因子(EGF)竞争拮抗TP40的细胞毒作用.结果 T24细胞表达EGFR强阳性.浓度为5、50、100、250、500、750和1 000 μg/L 的TP40处理T24细胞96 h,细胞生长抑制率分别为10%、19%、27%、41%、47%、53%和61%.用750 μg/L的TP40处理T24细胞24、48、72和96 h,[3H]-TdR掺入率分别为80%,69%,48%和51%.浓度为1～7 500 μg/L的EGF 对TP40有竞争抑制作用.结论人膀胱癌T24细胞能高水平地表达EGFR;重组TP40对T24细胞的生长具有剂量、时间依赖性抑制作用,该作用是通过EGFR进行的.
-
RNA干扰和伊马替尼杀伤K562细胞效果的比较
目的 比较RNA干扰(RNAi)和伊马替尼(imatinib)杀伤K562细胞的效果.方法 设计有效的bcr-abl干扰shRNA序列,利用基因工程技术插入到干扰载体构建RNAi质粒.测序鉴定正确的RNAi质粒转染K562细胞,48 h后荧光显微镜观察转染效率.RT-PCR技术检测K562细胞中hcr-ahl表达水平.同时,伊马替尼作用K562细胞.利用凋亡分析、MTT增生实验和磷酸化的酪氨酸蛋白含量检测来评估RNAi和伊马替尼作用效果.结果 与伊马替尼一样,RNAi使K562细胞凋亡增强,增生减少,磷酸化的酪氨酸蛋白含量减少.结论 RNAi达到伊马替尼杀伤K562细胞的效果,有望在临床用于治疗慢性髓细胞白血病(CML)患者,尤其是那些对伊弓替尼等化疗药物不敏感的CML患者.
-
稳定表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系的建立
目的 建立能够稳定分泌表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系.方法 依次将合成的编码TAT蛋白转导域和EGFP的DNA片段插入分泌型真核表达载体pSecTag2A,构建编码TAT-EGFP融合蛋白的重组质粒,转染Vero细胞后,经Zeocin筛选建系,通过荧光显微镜和免疫印迹鉴定表达的蛋白,MTT分析细胞毒性,荧光观察蛋白转导活性.结果 成功获得了稳定分泌表达TAT-EGFP融合蛋白的工程细胞系,表达的TAT融合蛋白具有良好的蛋白转导活性.结论 建立的哺乳动物细胞表达系统能够持续产生具有蛋白转导活性的TAT融合蛋白,为相关应用研究奠定了基础.
-
慢性髓系白血病bcr-abl融合基因在真核细胞中的表达
克隆慢性髓系白血病(CML)融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞，探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性。设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA，测序正确后，将其克隆至真核表达载体pcDNA 3.1，通过电穿孔法转染至p815 细胞中，应用G418筛选阳性细胞克隆，在含10%FCS的RPMI1640中常规培养，收集细胞进行RT-PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA，序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确；构建了重组真核表达载体，并用电穿孔法将其转染p815细胞，RT-PCR法检测到该细胞系有bcr-abl mRNA水平的表达。
-
CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在K562细胞中的定位及其与BCR-ABL蛋白的相互作用
目的 研究CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA两种融合肽在慢性粒细胞白血病(CML) K562细胞中的定位及其与BCR-ABL蛋白的相互作用.方法 将前期制备的CTP-OD 1-HA和CTP-OD2-HA融合肽转导入K562细胞,采用免疫荧光和Western blotting方法检测其入胞情况及胞内定位,His-pull down和CoIP实验检测融合肽与BCR-ABL的相互作用.结果 免疫荧光检测显示CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能穿过细胞膜进入细胞并定位于胞质,Western blotting也同时检测到进入细胞质中的两种融合肽.His-pull down实验结果表明,CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在细胞外均可直接与BCR-ABL蛋白结合,CoIP实验结果显示两种融合肽在K562细胞内也能与BCR-ABL蛋白结合并形成复合物.结论 CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能成功进入白血病K562细胞并定位于细胞质,且可与BCR-ABL蛋白发生相互作用.
-
PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Ab1的抑制作用观察
目的 探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Ab1定位的关系,以及对Bcr-Ab1寡聚化和Bcr-Ab1酪氨酸激酶活性的影响.方法 采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Ab1的相互作用,Western blotting检测Bcr-Ab1的磷酸化水平.结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性.PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Ab1共定位,且能与Bcr-Ab1蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Ab1同源寡聚化,并可降低Bcr-Ab1的磷酸化水平.结论 在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Ab1同源寡聚化及磷酸化水平.
-
谷胱甘肽-S-转移酶-人表皮生长因子融合蛋白基因的表达及其产物的生物活性
目的通过融合蛋白的表达使人表皮生长因子(hEGF)易于纯化.方法构建基于tac启动子的pGEX 4T-1-hEGF原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-1-硫代-β-D半乳糖苷诱导,表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-hEGF融合蛋白.结果表达产物占细菌总蛋白的34%.部分为可溶性的,部分形成包涵体.菌体裂解上清液经Glutathione Sepharose 4B纯化后,SDS-PAGE电泳出现一条32 ku蛋白条带,与GST-hEGF融合蛋白的计算分子量相符.菌体裂解液中的可溶性GST-hEGF的产率为63 mg·L-1.将其添加到培养的HEK-293细胞中,能明显促进该细胞的分裂和生长.结论成功地构建并表达了GST-hEGF融合蛋白基因,其表达产物GST-hEGF显示良好的促细胞增殖活性.
-
伊玛替尼治疗变异型BCR/ABL融合基因阳性的急性混合细胞白血病
目的 鉴定1例Ph染色体阳性的急性混合细胞白血病(AMLL)患者携带的变异型BCR/ABL融合基因,观察伊玛替尼治疗的疗效.方法 联合使用形态学、免疫分型、细胞遗传学和基因分析确定患者的变异型BCR/ABL融合基因,使用伊玛替尼治疗并定量检测该融合基因.结果 患者入院时检查Ph染色体阳性,荧光定量PCR未见BCR/ABL融合基因.形态学检查原始粒细胞比例0.66,免疫分型发现髓系和B系两群幼稚细胞.患者经化疗和骨髓移植疗效不佳,进一步检测发现新的变异型BCR/ABL融合基因(GenBank:EF423615),该融合蛋白较常见的BCR-ABL b2a2型缺失10个氨基酸并伴H893Q变异.遂用伊玛替尼治疗并迅速获得缓解,变异型融合基因表达量逐渐降低,5个月后转阴性.治疗中患者曾停药,变异型融合基因转为阳性,再次用药后又转为阴性.现患者已持续缓解12个月,生存状况良好.结论 变异型BCR/ABL融合基因可能和患者的特殊临床表现有关,使用伊玛替尼治疗获得了很好的疗效.
-
AML1-ETO对p21 WAF1/CIP1启动子转录活性作用的研究
目的 观察AML1-ETO融合基因对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的影响,探讨AML1-ETO促进白血病发生的机制.方法 构建p21WAF1/CIP1基因启动子的报告质粒,与AML1-ETO、AML1b和AML1a的表达质粒共转染非洲绿猴肾细胞系CV-1细胞,测定荧光素酶的活性,分析AML1-ETO、AML1b和AML1a对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的影响.结果 在CV-1细胞中,AML1-ETO对p21WAF1/CIP1基因启动子的转录具有明显的抑制作用,在pCMV5-AML1-ETO的剂量为1000 ng时,p21WAF1/CIP1启动子的转录活性下降为对照组的(19±4)%,这种作用具有序列特异性和剂量依赖性;AML1b和AML1a对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的抑制作用不明显,在剂量为1000 ng时,p21WAF1/C1P1启动子的转录活性分别下降为对照组的(61±16)%和(59±16)%.结论 AML1在与ETO形成融合基因后,其产物由于ETO蛋白能够更有效地募集转录共抑制复合物,其转录抑制活性要比AML1a和AML1b更强;外源的AML1-ETO对p21WAF1/CIP1的作用可能也与细胞系有关.
-
地塞米松协同vorinostat促进AML1-ETO蛋白泛素化降解诱导Kasumi-1细胞分化和凋亡
目的 探讨地塞米松联合组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂vorinostat对Kasumi-1细胞增殖、分化和凋亡的影响及可能的作用机制,为其用于治疗急性髓系白血病提供理论依据.方法 以二甲基亚砜为对照组,地塞米松(20nmol/L)、vorinostat(1 mmol/L)以及二者联合作用于Kasumi-1细胞24、48 h,用MTT法和流式细胞术检测Kasumi-1细胞的生长抑制率、分化抗原的表达和凋亡率.处理48 h后用Western blot法检测AML1-ETO蛋白水平,用免疫共沉淀-Western blot法检测其泛素化修饰的变化.结果 以地塞米松、vorinostat单独处理以及二者联合处理Kasumi-1细胞48 h,发现联合处理组Kasumi-1细胞的增殖抑制率、分化抗原CD13表达率和凋亡率分别为(42.06±8.20)％、(52.83±8.97)％、(52.92±2.53)％,对照组分别为(6.96±0.39)％、(21.73±2.03)％、(6.96±0.39)％,地塞米松组分别为(17.30±3.49)％、(22.53±4.51)％、(19.57±2.17)％,vorinostat组分别为(33.82±9.41)％、(43.93±9.04)％、(42.98±3.01)％,联合处理组较其他3组增高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).联合处理组与对照组和单药处理组比较,Kasumi-1细胞内AML 1-ETO蛋白水平下降,AML1-ETO泛素化修饰水平提高.结论 地塞米松和vorinostat通过协同促进AML1-ETO融合蛋白泛素化修饰和泛素蛋白酶体途径降解,抑制Kasumi-1细胞增殖,促进Kasumi-1细胞分化和凋亡.
-
慢性粒细胞白血病cyclin D2基因的表达研究
目的研究cyclin D2基因表达与慢性粒细胞白血病(CML)特征性的P21BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性之间的相关性.方法以RT-PCR、免疫印迹法及流式细胞术检测cyclin D2基因在BCR/ABL+K562细胞系中的表达.通过表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的模型即K562-ib-eGFP细胞,检测cyclinD2表达的变化.结果在P210BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性受抑制的K562-ib-eGFP细胞中,cyclinD2的表达(18.90%)明显低于K562细胞组(48.10%),且K562-ib-eGFP组S期细胞比例(40.40%)也明显低于K562细胞组(64.34%).结论cyclin D2可能是CML P210BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶下游相关信号传递分子,其表达增高可能促进了CML细胞的过度增殖.
-
葛根总黄酮体外诱导Kasumi-1细胞凋亡及其分子机制
目的 探讨葛根总黄酮(puerariae radix flavones,PRF)对人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞凋亡的影响,并对其可能的分子机制进行初步研究.方法 以不同浓度PRF作用Kasumi-1细胞48 h,瑞氏染色及Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡变化,FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时定量PCR技术检测AMLl -ETO融合基因表达,Western blot法检测Bcl-2、Bim及Caspase相关酶的变化.结果 PRF能有效诱导Kasumi-1细胞凋亡.以50、200及500 μg/ml的PRF分别处理细胞,其早期凋亡率依次为(14.1±0.8)％、(17.7±1.3)％及(32.4±1.4)％,较空白对照组[(7.8±0.7)％]明显增加(P＜0.05),作用呈浓度依赖性；抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量依次为0.85±0.05、0.62±0.07及0.43±0.05,呈下调趋势(P＜0.01)；而促凋亡蛋白Bim相对表达量分别为0.21±0.06、0.39±0.04及0.75 +0.05,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.92±0.04、1.21±0.07及1.33±0.04,Caspase-9蛋白相对表达量分别为0.35±0.05、0.53±0.03及0.69±0.07,均呈上调趋势(P＜0.01).Caspase-8蛋白表达量及AML1 -ETO融合基因表达量则无明显改变.结论 一定浓度PRF诱导Kasumi-1细胞凋亡可能与下调细胞Bcl-2、上调Bim及活化Caspase相关酶有关,与AML1 -ETO融合基因无明显相关性.
关键词： 葛根总黄酮 Kasumi-1细胞 融合蛋白质类 AML1-ETO 细胞凋亡
