首页 > 文献资料
-
中国t(8;21)AML患者临床特征及预后分析:一项多中心回顾性研究
目的:通过回顾性分析中国北方15个血液病研究中心的586例伴有t(8;21)的急性髓系白血病(AML)患者临床资料,总结其在外周血、免疫分型、融合基因、细胞遗传学改变等的临床特点.方法:用COX回归进行预后因素的单因素和多因素分析,探究能够影响t(8;21) AML患者预后生存的因素.结果:t(8;21) AML患者的免疫分型中以HLA-DR+、CD117+、CD34+、MPO+、CD38+、CD13+、CD33+多见(＞95％),部分患者伴有CD19+和CD56+;常见的伴随基因突变为C-KIT突变(37.8％);除t(8;21)异位外,常见的伴随染色体异常为性染色体缺失(38.9％);单因素分析显示,初诊时WBC≤3.5×109/L、不伴随C-KIT突变、做过HSCT的成人t(8;21)AML患者在OS、PFS上均有明显优势(P≤0.05),不伴有髓外浸润、CD19+患者仅在OS上具有优势;多因素分析显示,WBC≤3.5×109/L的患者在OS、PFS上均优于WBC ＞3.5×109/L的患者(P≤0.05).结论:中国的t(8;21)AML患者临床特征与报道的国外人群基本相似,WBC≤3.5×109/L是t(8;21) AML的预后良好因素,C-KIT突变是t(8;21)AML的预后不良因素.
-
AML1-ETO融合蛋白对p14ARF基因转录调控的影响
目的:探讨异常转录因子AMLl-ETO融合蛋白对p14ARF的转录调控机制.方法:应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞p14ARFmRNA的表达;用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对其p14ARF启动子的甲基化状态进行分析;染色质免疫沉淀技术(ChIP)研究转染细胞中AMLl-ETO与p14ARF启动子之间直接的相互作用情况;应用qRT-PCR检测5-氮杂胞苷(5-Aza)处理后细胞内p14ARFmRNA表达水平.结果:转染了AMLl-ETO的U937细胞系和具有AMLl-ETO融合基因的AML-M2患者中,p14ARF的mRNA表达水平下调;p14ARF启动子在对照组细胞株和无AMLl-ETO融合基因的AML-M2患者中处于非甲基化状态,在转染细胞株和具有AMLl-ETO融合基因的AML-M2患者中处于高甲基化状态;转染细胞沉淀富集的DNA中含有p14ARF的启动子序列;5-Aza能上调p14ARF mRNA的表达.结论:p14ARF是AML1-ETO融合蛋白可能的靶基因,p14ARF启动子高甲基化所致的基因沉默可能是M2b型白血病发生发展的一个重要因素.
-
丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用
本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(HDAC)丙戊酸钠(VPA)逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用.Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT-PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclin D2 mRNA水平的变化情况.结果表明:不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1-3 mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1 mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义.以3 mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3 mmol/L VPA组cyclin D2 mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2 mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义.结论:VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AML1/ETO融合蛋白的转录抑制并增加and-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2 mRNA的表达.
关键词： 组蛋白脱乙酰化酶 丙戊酸钠 Kasumi-l细胞株 AML1-ETO -
AML1、AML1-ETO对nucb2基因转录调控活性的影响
本研究旨在探讨造血特异转录因子AML1及M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)累及的异常融合蛋白AML1-ETO对凋亡相关基因nucb2(nucleobindin-2)启动子转录活性的影响,探索AML1-ETO对AML-M2b型白血病的分子致病机制.利用实时RT-PCR方法在AML1-ETO诱导型白血病细胞株中研究AML1-ETO在转录水平对于nueb2的调控情况;利用ChIP-qPCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株中研究AML1、AML1-ETO与nucb2基因启动子之间直接的体内相互作用情况;采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1、AML1-ETO对nucb2启动子转录活性的调节作用.结果表明:AML1-ETO的表达与nucb2的表达呈负相关;nucb2可能是AML1、AML1-ETO的靶基因;AML1、AML1-ETO皆对nucb2启动子具有转录抑制作用,且AML1-ETO对nucb2抑制更强.结论:nucb2是AML1、AML1-ETO的直接靶基因,AML1、AML1-ETO通过抑制nucb2启动子的活性对其进行转录调控.
-
白血病AML1-ETO融合蛋白转录结合位点在基因组水平的分布规律
本研究探讨白血病t(8;21)染色体易位形成的融合癌蛋白AML1-ETO在2、9、19号3条染色体上基因组水平的结合位点分布,从而探索其在白血病发生发展过程中异常的转录调控模式,为靶向治疗药物研发以及临床治疗方案优化提供理论基础.应用染色质免疫沉淀技术与高通量的基因芯片相结合的ChIP-on-chip技术,使用覆盖上述3条染色体上所有基因组信息的瓦式基因芯片,在具有t(8;21)染色体易位的Kasumi细胞株上展开研究.实验分为抗ETO特异抗体组和随机打断基因组DNA对照组.通过MAT方法分析ETO抗体组相对于对照组的富集片段;应用CEAS分析工具分析富集片段在基因组上的分布特征,并进一步通过功能富集分析方法挖掘其中潜藏的生物学意义.结果表明:ETO抗体组在2、9、19号染色体上共得到富集片段588条,这些片段在基因组的定位分布特征如下:5.96%位于基因启动子区域,5.49%位于基因外显子区域,48.86%位于增强子区域,37.35%位于基因内含子区域,1.27%位于即时下游区域,0.87%位于3'UTR,0.2%位于5'UTR.进一步功能富集分析结果显示:参与代谢调节、细胞增殖、信号传导等功能的模块在AML1-ETO的潜在靶基因中富集.结论:AML1-ETO融合蛋白在基因组上的结合位点过半分布在经典转录因子结合区域(启动子、5JTR和增强子),其余近半分布在非经典的区域,其下游调控的分子网络广泛涉及多种重要功能通路.
-
环腺苷酸拟似物8-CPT-cAMP诱导M2b型急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞分化的研究
为了解环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-CPT-cAMP)对M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)细胞的作用,以AML-M2b细胞株Kasumi-1细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、表面分化抗原、细胞周期分布以及对四氮唑蓝的还原能力的改变,研究8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞增殖及分化的影响,并应用半定量RT-PCR和Western blot检测药物处理前后Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合蛋白的变化.结果发现,8-CPT-cAMP(200 μmol/L)可明显抑制Kasumi-1细胞增殖而促使细胞趋向分化,但这种分化不是典型的完全终末性分化,8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合基因及其编码蛋白的表达无显著影响.结论:8-CPT-cAMP对AML-M2b细胞具有诱导分化效应.
-
应用实时定量PCR检测儿童急性髓系白血病AML1-ETO融合基因
目的 应用实时定量聚合酶链式反应方法,分析儿童急性髓系白血病中AML1-ETO融合基因的表达水平,探讨AML1-ETO表达水平的变化规律.方法 采用实时定量PCR方法,以AML1-ETO融合基因为靶分子,定量检测了28例急性髓系白血病患儿初诊时融合基因的表达量,分析了表达量与初诊临床特征的相关性,并对17例患者进行微小残留病定量分析.结果 患者AML1-ETO融合基因的表达范围在未治疗前达到17094～187800拷贝/106GAPDH拷贝;长期缓解的患者表达量降到0～46拷贝/106GAPDH拷贝;复发患者融合基因表达范围为62633.8～246000拷贝/106GAPDH拷贝.初诊时患者AML1-ETO融合基因的表达量与临床特征无相关性(P均＞0.05).结论 应用实时定量PCR技术对AML1-ETO的定量检测是判断和追踪该类白血病疗效的有力指标,可以较好地反映患者的微小残留病的动态变化.
-
5-氮杂脱氧胞苷增强苯丁酸钠对Kasumi-1细胞的诱导分化和凋亡作用
目的探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)联合DNA甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)阻断AML1-ETO的生物学功能,消除AML1-ETO的转录抑制,诱导t(8;21)急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞的分化和凋亡作用.方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察PB单药或联合5-Aza-CdR对细胞生长的抑制作用;流式细胞术分析细胞周期和检测髓系分化抗原CD11b和CD13的表达,判断细胞分化;Annexin V和碘化丙啶(PI)双标记,经流式细胞术分析细胞早期凋亡.结果(1)5-Aza-CdR可增强PB对Kasumi-1细胞的生长抑制作用,半数抑制浓度(IC50)下降为1.95mmol/L.(2)PB处理使Kasumi-1细胞阻滞于G0/G1期,5-Aza-CdR与PB联合则使细胞阻滞于G2/M期.(3)低剂量5-Aza-CdR增强PB诱导Kasumi-1细胞髓系分化抗原CD11b和CD13的表达.(4)低剂量5-Aza-CdR不能增强PB诱导的Kasumi-1细胞凋亡,而高剂量5-Aza-CdR增强PB诱导的Kasumi-1细胞早期凋亡.结论DNA甲基化抑制剂5-Aza-CdR增强脱乙酰化酶抑制剂PB抑制Kasumi-1细胞生长、诱导分化和凋亡的作用.
-
齐墩果酸诱导Kasumi-1细胞凋亡及对AML1-ETO表达的影响
目的 观察齐墩果酸(OA)诱导入急性髓系白血病M2型细胞株Kasumi-1凋亡及对AML1-ETO表达的影响.方法 用不同浓度OA作用于人急性髓系白血病M2型Kasumi-1细胞株,四氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率；Annexin V/PI双染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot法检测AML1-ETO蛋白表达水平；荧光原位杂交(Fish)检测融合基因AML1-ETO的变化.结果 OA以时间和剂量依赖方式抑制Kasumi-1细胞的增殖,24,48,72 h的IC50分别约为0.58,0.41,0.35 μmol·L-1.不同浓度(0.4,0.6,0.9μmol·L-1)OA作用24h后,细胞凋亡率明显增加,AML1-ETO蛋白表达下调.结论 OA对Kasumi-1细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用可能与AML1-ETO的抑制有关.
关键词： 齐墩果酸 Kasumi-1细胞 细胞凋亡 AML1-ETO -
以聚合酶链反应确诊中枢神经系统白血病一例
患者男,27岁.2004年6月诊断为急性粒细胞白血病,部分分化型(M2型),核型分析示46,XY,t(8;21),AML1-ETO表达(+).化疗达完全缓解后多方案巩固治疗t年.后停止治疗.2007年3月无明显诱因出现双侧臀部及双下肢疼痛麻木,呈放射性,不伴有发热等其他不适,CT示腰椎间盘突出,相应处理后症状稍缓解.
-
AML1-ETO对p21 WAF1/CIP1启动子转录活性作用的研究
目的 观察AML1-ETO融合基因对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的影响,探讨AML1-ETO促进白血病发生的机制.方法 构建p21WAF1/CIP1基因启动子的报告质粒,与AML1-ETO、AML1b和AML1a的表达质粒共转染非洲绿猴肾细胞系CV-1细胞,测定荧光素酶的活性,分析AML1-ETO、AML1b和AML1a对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的影响.结果 在CV-1细胞中,AML1-ETO对p21WAF1/CIP1基因启动子的转录具有明显的抑制作用,在pCMV5-AML1-ETO的剂量为1000 ng时,p21WAF1/CIP1启动子的转录活性下降为对照组的(19±4)%,这种作用具有序列特异性和剂量依赖性;AML1b和AML1a对p21WAF1/CIP1基因启动子转录活性的抑制作用不明显,在剂量为1000 ng时,p21WAF1/C1P1启动子的转录活性分别下降为对照组的(61±16)%和(59±16)%.结论 AML1在与ETO形成融合基因后,其产物由于ETO蛋白能够更有效地募集转录共抑制复合物,其转录抑制活性要比AML1a和AML1b更强;外源的AML1-ETO对p21WAF1/CIP1的作用可能也与细胞系有关.
-
地塞米松协同vorinostat促进AML1-ETO蛋白泛素化降解诱导Kasumi-1细胞分化和凋亡
目的 探讨地塞米松联合组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂vorinostat对Kasumi-1细胞增殖、分化和凋亡的影响及可能的作用机制,为其用于治疗急性髓系白血病提供理论依据.方法 以二甲基亚砜为对照组,地塞米松(20nmol/L)、vorinostat(1 mmol/L)以及二者联合作用于Kasumi-1细胞24、48 h,用MTT法和流式细胞术检测Kasumi-1细胞的生长抑制率、分化抗原的表达和凋亡率.处理48 h后用Western blot法检测AML1-ETO蛋白水平,用免疫共沉淀-Western blot法检测其泛素化修饰的变化.结果 以地塞米松、vorinostat单独处理以及二者联合处理Kasumi-1细胞48 h,发现联合处理组Kasumi-1细胞的增殖抑制率、分化抗原CD13表达率和凋亡率分别为(42.06±8.20)％、(52.83±8.97)％、(52.92±2.53)％,对照组分别为(6.96±0.39)％、(21.73±2.03)％、(6.96±0.39)％,地塞米松组分别为(17.30±3.49)％、(22.53±4.51)％、(19.57±2.17)％,vorinostat组分别为(33.82±9.41)％、(43.93±9.04)％、(42.98±3.01)％,联合处理组较其他3组增高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).联合处理组与对照组和单药处理组比较,Kasumi-1细胞内AML 1-ETO蛋白水平下降,AML1-ETO泛素化修饰水平提高.结论 地塞米松和vorinostat通过协同促进AML1-ETO融合蛋白泛素化修饰和泛素蛋白酶体途径降解,抑制Kasumi-1细胞增殖,促进Kasumi-1细胞分化和凋亡.
-
苯丁酸钠联合5-氮杂脱氧胞苷抑制Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤的生长
目的探讨组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂苯丁酸钠(PB)联合5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对t(8;21)急性髓系白血病裸鼠移植瘤模型的抑瘤活性与作用机制.方法用Kasumi-1细胞皮下接种的方法建立t(8;21)急性髓系白血病裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠的致瘤潜伏期、PB预处理Kasumi-1细胞的致瘤性改变,以及PB和5-Aza-CdR腹腔注射对移植瘤生长的抑制作用.流式细胞术检测细胞分化抗原和细胞周期,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP原位缺口末端标记(TUNEL)检测瘤组织凋亡,免疫组织化学染色检测血管新生.结果切脾和不切脾裸鼠接种Kasumi-1细胞后致瘤潜伏期分别为17～23 d和40～50 d,瘤细胞不转移,仍检测出t(8;21)和AML1-ETO融合基因.接种PB预处理Kasumi-1细胞的裸鼠未见成瘤.PB、5-Aza-CdR单独或联合裸鼠体内用药后,移植瘤生长抑制率分别为49.07%、25.69%和87.46%(P＜0.05),凋亡细胞指数分别为(2.25±0.85)%、(1.32±0.68)%和(5.41±1.56)%(P＜0.05),微血管密度(MVD)分别为21.69±6.25,28.34±4.24和9.48±3.21(P＜0.01),与对照组相比有显著性差异(P值均＜0.05).PB腹腔注射后移植瘤细胞CD11b、CD13表达增高[(12.08±1.02)%和(54.91±2.72)%],G0/G1期细胞增加[(65.20±0.12)%],而S期细胞减少[(26.55±0.38)%].结论PB可降低Kasumi-1细胞致瘤性,并通过诱导Kasumi-1瘤细胞分化、凋亡和抑制移植瘤血管新生而抑制肿瘤生长;5-Aza-CdR能显著增强PB的体内抗肿瘤活性.
-
葛根总黄酮体外诱导Kasumi-1细胞凋亡及其分子机制
目的 探讨葛根总黄酮(puerariae radix flavones,PRF)对人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞凋亡的影响,并对其可能的分子机制进行初步研究.方法 以不同浓度PRF作用Kasumi-1细胞48 h,瑞氏染色及Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡变化,FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时定量PCR技术检测AMLl -ETO融合基因表达,Western blot法检测Bcl-2、Bim及Caspase相关酶的变化.结果 PRF能有效诱导Kasumi-1细胞凋亡.以50、200及500 μg/ml的PRF分别处理细胞,其早期凋亡率依次为(14.1±0.8)％、(17.7±1.3)％及(32.4±1.4)％,较空白对照组[(7.8±0.7)％]明显增加(P＜0.05),作用呈浓度依赖性；抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量依次为0.85±0.05、0.62±0.07及0.43±0.05,呈下调趋势(P＜0.01)；而促凋亡蛋白Bim相对表达量分别为0.21±0.06、0.39±0.04及0.75 +0.05,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.92±0.04、1.21±0.07及1.33±0.04,Caspase-9蛋白相对表达量分别为0.35±0.05、0.53±0.03及0.69±0.07,均呈上调趋势(P＜0.01).Caspase-8蛋白表达量及AML1 -ETO融合基因表达量则无明显改变.结论 一定浓度PRF诱导Kasumi-1细胞凋亡可能与下调细胞Bcl-2、上调Bim及活化Caspase相关酶有关,与AML1 -ETO融合基因无明显相关性.
关键词： 葛根总黄酮 Kasumi-1细胞 融合蛋白质类 AML1-ETO 细胞凋亡 -
实时定量RT-PCR方法监测急性髓系白血病患者造血干细胞移植后AML1-ETO融合基因mRNA水平的临床意义
目的 评价实时定量RT-PCR(Q-PCR)方法监测AML1-ETO(+)急性髓系白血病(AML)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后AML1-ETO mRNA水平的表达及其临床意义.方法 采用基于TagMan探针的Q-PCR技术检测17例AML1-ETO(+)AML患者allo-HSCT后不同时间骨髓标本AML1-ETO mRNA的表达.AML1-ETO mRNA水平以内参基因abl进行归一化.采用荧光原位杂交(FISH)法评估HSCT后是否达到细胞遗传学完全缓解(CCyR).结果 Q-PCR实验可重复敏感度为5个拷贝.在16例CCyR患者中,1例死于移植物抗宿主病(GVHD),1例死于感染,其余14例中位随访时间为268(70～811)d,HSCT后1个月(+1月)AML1-ETO中位水平0(0～0.740),+2月为0.026(0～2.900),+3月为0.039(0～3.300).移植时间超过12个月的5例患者中,中位随访685(385～811)d,4例仍呈AML1-ETO阳性,中位值0.078(0.003～0.120).1例复发患者+1月为0,+2月为9.800,+3月为5.600,+110 d血液学复发,AML1-ETO mRNA为390.000,+382 d死亡.结论 1年内AML1-ETO持续低水平阳性不一定预示复发;对AML1-ETO(+)AML患者HSCT后定期动态监测AML1-ETO水平十分必要.
-
脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠体外诱导Kasumi-1细胞分化和凋亡作用
目的探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)体外阻断AML1-ETO的生物学功能,消除AML1-ETO的转录抑制,诱导Kasumi-1细胞生长抑制、分化和凋亡作用.方法应用MTT比色法观察PB对细胞的生长抑制作用,普通光学显微镜和透射电镜观察细胞形态和结构改变,流式细胞术分析细胞周期和检测髓系分化抗原的表达,Annexin Ⅴ标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡.结果① PB明显抑制Kasumi-1细胞的生长,半数抑制浓度(IC50)约为2.3?mmol/L;②经PB作用后细胞阻滞于G0/G1期,伴有S期细胞减少;③ PB可诱导Kasumi-1细胞髓系分化抗原CD11b和CD13表达增加,并呈剂量和时间依赖性;④ PB诱导Kasumi-1细胞凋亡,呈时间剂量依赖性,PB 3 mmol/L培养2 d早期凋亡细胞增加,培养3 d晚期凋亡细胞增加,培养5 d出现明显DNA梯形条带;⑤处理后的细胞出现单核细胞样分化和凋亡细胞形态改变.结论脱乙酰化酶抑制剂PB抑制Kasumi-1细胞生长,使细胞阻滞于G0/G1期;诱导细胞部分分化和凋亡.
-
定量检测WT1基因表达水平在急性髓系白血病微量残留病监测中的意义
目的评价定量检测WT1基因表达水平在监测急性髓系白血病(AML)微量残留病(MRD)中的意义.方法采用实时定量RT-PCR(RQ-PCR)技术分别测定了15名正常人骨髓及72例AML患者治疗前后123份骨髓标本WT1基因mRNA表达水平,同时对62份患者标本定量检测了AML1-ETO融合基因mRNA表达水平,对跟踪观察的8例患者50份标本同时监测了WT1及AML1-ETO基因mRNA水平变化.WT1及AML1-ETO基因表达水平用内参照基因ABL归一化.结果WT1、AML1-ETO及ABL RQ-PCR的标准曲线相关系数均＞0.99,日内差及日间差均＜4%.正常骨髓WT1 mRNA中位水平为0.008(0.001～0.019).67例初治AML患者中61例(91.0%)WT1 mRNA表达高于正常水平,其中37例(55.2%)高于正常100倍以上.各型AML中M4EO及M3患者WT1mRNA水平高,明显高于其他亚型,M1及M5型低.WT1与AML1-ETO mRNA水平明显正相关(r=0.88,P＜0.001),4例血液学持续缓解患者中3例WT1 mRNA水平始终在正常范围内波动.4例发生血液学复发的患者中3例复发前1个月WT1 mRNA的水平分别超出正常上限的31.4,11.4及4.0倍.结论RQ-PCR定量检测WT1 mRNA水平可用于监测大多数AML患者MRD,但是敏感度不如AML1-ETO融合基因,WT1 mRNA水平持续增高或明显异常预示复发.
-
AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响
目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.
-
RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用
目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.
关键词： RNA干扰 融合蛋白 AML1-ETO Kasumi-1细胞 细胞周期 -
融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影
背景:已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞.目的:观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用.方法:应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14 的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPα mRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况.结果与结论:AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b 和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列.结果提示C/EBPα是AML1-ETO 的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达.
