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RNA干扰TAK1表达以增强三氧化二砷抑制Kasumi-1细胞增殖的作用及其机制研究
目的:探讨沉默转化生长因子β激活激酶(TAK1)基因表达对三氧化二砷(As2O,)抑制人t(8;21)急性髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖的影响及其可能机制.方法:实验分为4组:对照组,TAK1特异siRNA转染Kasu-mi-1细胞组,As2 O3作用组及两者联合处理的Kasumi-1细胞组.采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测TAK1、p-JNK及凋亡相关蛋白的表达.结果:在0.5-20 μmol/L范围内,As2O3作用于Kasumi-1细胞24h能够浓度依赖性地抑制Kasumi-1细胞增殖,24 h的IC50值为(3.79±0.36)μmol/L;在0.5-10 μmol/L范围内,As2O3作用于Kasumi-1细胞48 h能够浓度依赖性地抑制Kasumi-1细胞增殖;之后As2O3对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用进入平台期,48 h的IC50值为(2.38±0.17)μmol/L.TAK1siRNA转染组和As2O3 3.5 μmol/L作用24 h组,Kasumi-1细胞的增殖抑制率分别为(10.86±1.64)％和(49.80±2.19)％,凋亡率分别为(8.47±0.75)％和(24.78±2.14)％,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);两者联合作用于Kasumi-1细胞的增殖抑制率为(65.63±0.83)％,凋亡率为(68.97±2.94)％,与对照组和各单独组比较,差异均有统计学意义(P＜0.001).TAK1 siRNA转染和As2 O3作用Kasumi-1细胞24 h能不同程度下调TAK1、p-JNK、c-Fos、c-Jun、BCL-2的表达,上调BAX和活化型(cleaved) Caspase-3、9的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),两者联合后该作用进一步加强(P＜0.05).结论:利用RNA干扰技术沉默TAK1表达能够增强As2O3抑制Kasumi-1细胞增殖的作用,其原因可能是通过TAK1下游的JNK信号传导通路,以及线粒体途径诱导细胞凋亡实现的.
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凋亡抑制蛋白c-FLIP高表达与白血病细胞耐药的关系
目的:探讨抗凋亡蛋白c-FLIP的表达对于白血病细胞系Kasumi-1细胞耐药的作用及其机制.方法:应用Tet-on系统,通过强力霉素(doxycycline,Dox)调控c-FLIP的条件性表达;将c-FLIP基因与慢病毒目的载体pLVX-Tight-puro连接,感染Kasumi-1细胞并获得稳定表达c-FLIP蛋白的稳定克隆;应用实时荧光定量PCR和Western blot方法证实c-FLIP在mRNA和蛋白水平的过表达情况;通过流式细胞术分析Fas激动剂CH11和HDAC抑制剂苯丁酸钠处理的Kasumi-1细胞的凋亡变化,以及过表达c-FLIP蛋白后对凋亡发生的影响;应用吉姆萨染色观察细胞凋亡形态变化,Westem blot检测caspase-8凋亡信号通路的激活情况.结果:CH11和苯丁酸钠能够诱导Kasumi-1细胞凋亡,在Kasumi-1细胞过表达c-FLIP蛋白后,细胞能够抵抗CH11和苯丁酸钠诱导的凋亡;Westernblot显示c-FLIP过表达阻滞了caspase-8凋亡信号通路的激活.结论:c-FLIP基因高表达使白血病细胞系Kasumi-1细胞对CH11和苯丁酸钠产生耐药作用.
关键词： c-FLIP 白血病 Kasumi-1细胞 白血病细胞耐药 -
新型青蒿素衍生物SM1044诱导Kasumi-1细胞凋亡及机制的研究
本研究探讨新型水溶性青蒿素衍生物SM1044对人急性髓系白血病M2b细胞株Kasumi-1的诱导凋亡作用及其机制.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法观察SM1044对细胞生长的抑制作用;Annexin-V/PI双标记流式细胞术、P1单标记流式细胞术分别检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测加药处理后Kasumi-1细胞凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP以及融合蛋白AML1-ETO的变化.结果显示:青蒿素衍生物SM1044可抑制Kasumi-1细胞的增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性;1 μmol/L SM1044作用24小时,生长抑制率达到50%,48小时的IC50值为0.17±0.067 μmol/L;SM1044通过Caspase依赖的途径诱导Kasumi-1细胞凋亡,细胞凋亡率随药物浓度的增加而增加.细胞周期测定显示,SM1044阻滞细胞周期于G0/G1期,5 μmol/L SM1044作用24小时使Go/G1期细胞由(58.33±4.46)%上升为(71.75±2.24)%;Western blot测定显示SM1044促使凋亡相关蛋白cCaspase 3(cleaved Caspase 3)、cPARP(cleaved PARP)表达水平增加,同时融合蛋白AML1-ETO表达降低.结论:SM1044可有效抑制Kasumi-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,该过程与cCaspase 3、cPARP蛋白的表达上调有关.SM1044还能阻滞细胞周期,将Kasumi-1细胞阻滞在G0/G1期;同时SM1044能明显引起融合蛋白AML1-ETO的表达降低,可作为SM1044作用的胞内靶点.
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环腺苷酸拟似物8-CPT-cAMP诱导M2b型急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞分化的研究
为了解环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-CPT-cAMP)对M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)细胞的作用,以AML-M2b细胞株Kasumi-1细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、表面分化抗原、细胞周期分布以及对四氮唑蓝的还原能力的改变,研究8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞增殖及分化的影响,并应用半定量RT-PCR和Western blot检测药物处理前后Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合蛋白的变化.结果发现,8-CPT-cAMP(200 μmol/L)可明显抑制Kasumi-1细胞增殖而促使细胞趋向分化,但这种分化不是典型的完全终末性分化,8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合基因及其编码蛋白的表达无显著影响.结论:8-CPT-cAMP对AML-M2b细胞具有诱导分化效应.
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齐墩果酸诱导Kasumi-1细胞凋亡及对AML1-ETO表达的影响
目的 观察齐墩果酸(OA)诱导入急性髓系白血病M2型细胞株Kasumi-1凋亡及对AML1-ETO表达的影响.方法 用不同浓度OA作用于人急性髓系白血病M2型Kasumi-1细胞株,四氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率；Annexin V/PI双染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot法检测AML1-ETO蛋白表达水平；荧光原位杂交(Fish)检测融合基因AML1-ETO的变化.结果 OA以时间和剂量依赖方式抑制Kasumi-1细胞的增殖,24,48,72 h的IC50分别约为0.58,0.41,0.35 μmol·L-1.不同浓度(0.4,0.6,0.9μmol·L-1)OA作用24h后,细胞凋亡率明显增加,AML1-ETO蛋白表达下调.结论 OA对Kasumi-1细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用可能与AML1-ETO的抑制有关.
关键词： 齐墩果酸 Kasumi-1细胞 细胞凋亡 AML1-ETO -
葛根总黄酮体外诱导Kasumi-1细胞凋亡及其分子机制
目的 探讨葛根总黄酮(puerariae radix flavones,PRF)对人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞凋亡的影响,并对其可能的分子机制进行初步研究.方法 以不同浓度PRF作用Kasumi-1细胞48 h,瑞氏染色及Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡变化,FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时定量PCR技术检测AMLl -ETO融合基因表达,Western blot法检测Bcl-2、Bim及Caspase相关酶的变化.结果 PRF能有效诱导Kasumi-1细胞凋亡.以50、200及500 μg/ml的PRF分别处理细胞,其早期凋亡率依次为(14.1±0.8)％、(17.7±1.3)％及(32.4±1.4)％,较空白对照组[(7.8±0.7)％]明显增加(P＜0.05),作用呈浓度依赖性；抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量依次为0.85±0.05、0.62±0.07及0.43±0.05,呈下调趋势(P＜0.01)；而促凋亡蛋白Bim相对表达量分别为0.21±0.06、0.39±0.04及0.75 +0.05,Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.92±0.04、1.21±0.07及1.33±0.04,Caspase-9蛋白相对表达量分别为0.35±0.05、0.53±0.03及0.69±0.07,均呈上调趋势(P＜0.01).Caspase-8蛋白表达量及AML1 -ETO融合基因表达量则无明显改变.结论 一定浓度PRF诱导Kasumi-1细胞凋亡可能与下调细胞Bcl-2、上调Bim及活化Caspase相关酶有关,与AML1 -ETO融合基因无明显相关性.
关键词： 葛根总黄酮 Kasumi-1细胞 融合蛋白质类 AML1-ETO 细胞凋亡 -
组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对Kasumi-1细胞血管新生相关因子表达的影响
目的 研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸钠(VPA)及曲古菌素(TSA)对白血病细胞系Kasumi-1细胞血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(KDR或FLK-1)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响,探讨其抗白血病血管新生的可能机制.方法 采用RT-PCR及Western blot方法 分析不同浓度VPA、TSA处理Kasumi-1细胞3 d后VEGF及其受体KDR mRNA及蛋白水平的变化,RT-PCR检测bFGF mRNA水平的变化.结果 VPA能够下调VEGF mRNA(3 mmol/L时处理组VEGF121 0.034±0.004、VEGF165 0.015±0.001,对照组分别为0.632±0.014、0.526±0.021)、KDRmRNA(3 mmol/L组0.038±0.000对0.258±0.034)及蛋白的表达,下调bFGF mRNA(3 mmol/L组0.086±0.015对0.228±0.017)的表达;TSA对VEGF、KDR mRNA及蛋白表达的影响与VPA相似,较高浓度的TSA能够下调bFGF mRNA的表达.结论 HDAC抑制剂可能通过调节血管新生相关因子及受体的表达,阻碍白血病患者的血管新生,从而抑制白血病的进展.
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三氧化二砷联合佛波酯对Kasumi-1细胞增殖的抑制作用及其机制
目的 探讨三氧化二砷(As2O3)联合佛波酯(TPA)对急性早幼粒细胞白血病细胞系Kasumi-1细胞的增殖抑制作用及机制.方法 用200 nmol/L TPA、不同浓度As2O3单独及联合作用于Kasumi-1细胞,用CCK-8法观察细胞增殖抑制率,Annexin Ⅴ法测定细胞凋亡率,集落形成实验检测集落形成率,流式细胞术检测细胞分化及细胞周期改变,Western blot法检测P38及磷酸化P38蛋白的表达.结果 TPA联合不同浓度As2O3(0.2、2.0、20.0 μmol/L)作用于Kasumi-1细胞48 h的增殖抑制率分别为(25.56±7.29)％、(60.63±6.64)％、(73.37±2.15)％,细胞凋亡率为(61.65±2.62)％、(75.39± 1.04)％、(89.95±1.46)％,集落形成率为(76.17±2.06)％、(38.50±1.87)％、(18.53±2.20)％,与不同浓度As2O3单药组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);TPA可促使Kasumi-1细胞向单核巨噬细胞分化;TPA可使Kasumi-1细胞阻滞于G1期,As2O3可使Kasumi-1细胞阻滞于G2期,TPA可增强As2O3对细胞周期的影响;TPA与As2O3联用可增强As2O3促磷酸化P38蛋白表达.结论 TPA与As2O3联合作用能增强As2O3的促凋亡作用及对细胞周期的影响,增强其抗白血病作用.
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RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用
目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.
关键词： RNA干扰 融合蛋白 AML1-ETO Kasumi-1细胞 细胞周期 -
sCD40L对白血病Kasumi-1细胞的影响及机制
目的·探讨可溶性CD40配体(sCD40L)对体外培养白血病Kasumi-1细胞增殖、凋亡的影响及分子机制.方法·用不同梯度浓度sCD40L处理Kasumi-1细胞,在24、48、72 h测定细胞增殖率,以筛选优化的干预浓度和时间.用优化的sCD40L浓度和时间干预处理Kasumi-1细胞后,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布;采用免疫印迹法(Westem blotting)检测凋亡因子Cytc、Bax、Bid和Bcl-2的表达;采用ELISA法检测sCD40L处理后Kasumi-1细胞培养上清液中IL-17含量.结果·sCD40L体外佳干预实验浓度和时间分别为4 μg/mL和48 h.经sCD40L处理后,Kasumi-1细胞体外增殖明显受到抑制,同时凋亡率明显升高;细胞周期分布表现为G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低;促凋亡因子Bax、Bid、Cytc表达水平明显升高,抗凋亡因子Bcl-2表达水平显著降低;Kasumi-1细胞培养上清液中IL-17含量明显增高.结论·sCD40L可显著抑制Kasumi-1细胞增殖并促进其凋亡,其作用机制与线粒体通路及上调IL-17表达水平有关.
关键词： sCD40L Kasumi-1细胞 增殖 凋亡 -
靶向AMLl/ETO的siRNA增强Kasumi-1细胞对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的敏感性
目的 探讨AML1/ETO融合基因沉默后kasumi-1细胞株对组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)丙戊酸钠(VPA)的敏感性变化.方法 体外培养人急性髓系白血病细胞株kasumi-1,脂质体介导重组质粒pGCsiRNA-AML1/ETO转染kasumi-1,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Kasumi-1细胞AML1/ETO和Bcl-2 muRNA的表达变化;MTT法检测VPA对细胞增殖的影响;流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化.结果 靶向AML1/ETO基因的siRNA质粒可有效降低Kasumi-1细胞AML1/ETO基因的表达;与空白对照组相比,转染组细胞AML1/ETO基因mRNA表达量下降了53.7%(P＜0.05),同时Bcl-2 mRNA的表达量下降了54.5%(P＜0.05),而阴性对照组及脂质体组两基因的表达量无明显变化;VPA对Kasumi-1细胞增殖的抑制作用呈浓度、时间依赖性,不同VPA浓度作用下,转染组细胞24、48 h的抑制率均高于空白对照组(P＜0.05),而阴性对照组及脂质体组与空白对照组相比无明显变化.空白对照组及转染组细胞G0/G1期比例分别为(42.07±5.23)%和(62.6±5.87)%(P＜0.01),经含2mmol/LVPA的培养基培养48 h后,两组细胞GO/G1期比例分别上升至(69.2±7.02)%和(78.92±6.23)%(P＜0.01);转染后细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变.结论 特异性AML1/ETO siRNA可显著抑制Kasumi-1细胞AML1/ETO基因的表达,并明显增强Kasumi-1细胞对VPA的敏感性.
关键词： RNA干扰 AML1/ETO融合基因 Kasumi-1细胞 丙戊酸钠 -
PEITC 诱导人 AML-M2白血病细胞凋亡机制的初步探讨
目的：证实苯乙基异硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate ，PEITC）诱导人急性髓系白血病（AML） M2白血病细胞系Kasumi‐1细胞凋亡的效应，初步探讨PEITC诱导Kasumi‐1细胞凋亡的机制。方法培养人M2白血病细胞株Kasumi‐1细胞，CCK‐8法检测不同浓度 PEITC处理后Ka‐sumi‐1细胞的增殖抑制率；流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡和活性氧（reactive oxygen species ， ROS）生成的情况；Real‐time PCR及Western blot检测 HO‐1以及凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9 mRNA及蛋白水平的变化。结果 CCK‐8结果显示PEITC作用Kasumi‐1细胞24 h、48 h、72 h后，细胞增殖抑制率呈现浓度－时间依赖性。流式细胞术显示 PEITC能够诱导Kasumi‐1细胞的凋亡。Real‐time PCR及Western blot结果显示PEITC处理细胞后，HO‐1表达下降，而凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9的表达上调。DCFH‐DA探针法显示 PEITC作用Kasumi‐1细胞后，ROS生成增多。结论 PEITC能够促进Kasumi‐1细胞凋亡，呈时间剂量梯度依赖关系；PEITC诱导Kasumi‐1细胞凋亡可能通过的机制包括下调 HO‐1表达促进 ROS 生成及凋亡相关基因Caspase3、Caspase8、Caspase9的激活。
关键词： 苯乙基异硫氰酸酯 Kasumi-1细胞 血红素加氧酶-1 活性氧
