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流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值
目的：建立一种人外周血γδΤ细胞细胞内白细胞介素?2（ IL?2）的检测方法。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（ PBMC），用结核杆菌低分子多肽抗原（ Mtb?Ag）刺激PBMC，获取较高比例的γδΤ细胞。用佛波醇酯＋离子霉素（ PMA＋IM）刺激PBMC和γδΤ细胞，用蛋白转运抑制剂（ Brefeldin A，BFA）阻断细胞内因子的分泌，用皂角素破膜，流式细胞术检测CD3＋T细胞内CD69阳性率，以确定佳的破膜时间，用流式细胞术检测γδΤ细胞内的IL?2的表达。不同组间CD3＋T细胞内CD69阳性率及细胞内IL?2的阳性率比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用小显著性（ LSD）法检验．。结果刺激时间不同，CD3＋T细胞胞内CD69的阳性率表达不同，皂角素破膜时间为15 min时，CD3＋T细胞胞内 CD69的阳性率高，达（87．82±2．28）％，与处理5 min[CD69的阳性率（66．86±1．99）％]和25 min[CD69的阳性率（81．73±2．51）％]比较，差异有统计学意义（ F ＝112．81， P＜0．05）；不同处理组γδΤ细胞内IL?2表达不同，γδΤ细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时表达高，达（50．65±6．25）％，与γδΤ细胞组（0．55±0．07）％、γδΤ细胞＋PMA＋IM组（0．91±0．12）％和PBMC＋PMA＋IM＋BFA组（0．21±0．03）％比较，差异有统计学意义（ F ＝321．07， P＜0．05）。结论流式细胞术是一种检测γδΤ细胞内IL?2的较好方法，为γδΤ细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。
关键词： γδΤ细胞 白细胞介素2 佛波醇酯类 离子霉素 结核杆菌低分子多肽抗原 -
钙泵间接激活剂对噪声性聋的保护作用
目的探讨Ca2+泵间接激活剂佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)对噪声性聋的保护作用.方法杂色豚鼠随机分为2组:PMA组和人工外淋巴液组(对照组),分别全耳蜗灌流3 μmol/L PMA和人工外淋巴液并暴露于100 dB SPL的白噪声持续120 min.于噪声暴露前和噪声暴露后120 min圆窗记录耳蜗微音电位(cochlear microphonics, CM)和耳蜗听神经复合动作电位(compound action potential,CAP).比较两组相同时间点的CM幅度和CAP阈值.结果噪声暴露前两组CM幅度和CAP阈值差异无显著性(P>0.05).噪声暴露后两组CM幅度下降和CAP阈值升高,但PMA组CM 幅度高于对照组,CAP阈值低于对照组(P<0.05).结论 Ca2+泵间接激活剂PMA对噪声性聋有部分保护作用.间接证明细胞内钙离子超载是噪声性聋的损伤机制之一.
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三氧化二砷联合佛波酯对Kasumi-1细胞增殖的抑制作用及其机制
目的 探讨三氧化二砷(As2O3)联合佛波酯(TPA)对急性早幼粒细胞白血病细胞系Kasumi-1细胞的增殖抑制作用及机制.方法 用200 nmol/L TPA、不同浓度As2O3单独及联合作用于Kasumi-1细胞,用CCK-8法观察细胞增殖抑制率,Annexin Ⅴ法测定细胞凋亡率,集落形成实验检测集落形成率,流式细胞术检测细胞分化及细胞周期改变,Western blot法检测P38及磷酸化P38蛋白的表达.结果 TPA联合不同浓度As2O3(0.2、2.0、20.0 μmol/L)作用于Kasumi-1细胞48 h的增殖抑制率分别为(25.56±7.29)％、(60.63±6.64)％、(73.37±2.15)％,细胞凋亡率为(61.65±2.62)％、(75.39± 1.04)％、(89.95±1.46)％,集落形成率为(76.17±2.06)％、(38.50±1.87)％、(18.53±2.20)％,与不同浓度As2O3单药组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);TPA可促使Kasumi-1细胞向单核巨噬细胞分化;TPA可使Kasumi-1细胞阻滞于G1期,As2O3可使Kasumi-1细胞阻滞于G2期,TPA可增强As2O3对细胞周期的影响;TPA与As2O3联用可增强As2O3促磷酸化P38蛋白表达.结论 TPA与As2O3联合作用能增强As2O3的促凋亡作用及对细胞周期的影响,增强其抗白血病作用.
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蛋白激酶C对生长激素释放激素调节人垂体腺瘤激素分泌作用的影响
目的 旨在探讨蛋白激酶C调节剂对原代培养人垂体腺瘤细胞分泌生长激素和催乳素作用的影响.方法 经原代培养的人垂体腺瘤细胞与佛波醇酯共同培养,通过放射免疫学方法检测生长激素和催乳素水平,评价佛波醇酯对生长激素释放激素调节垂体腺瘤激素分泌作用的影响;同时应用DNA序列分析确定gsp癌基因突变率.结果 gsp癌基因鉴定显示,18例垂体腺瘤组织标本中6例gsp癌基因表达阳性,5例突变位于201密码子,1例位于207密码子.佛波醇酯强烈刺激生长激素和催乳素的分泌并增强生长激素释放激素的刺激分泌作用,大效应浓度为100nmol/L,使生长激素分泌水平增加2～30倍;Staurosporine作用则相反,大多数肿瘤细胞表现为明显的抑制效应,而且与gsp癌基因不相关;联合应用生长激素释放激素和佛波醇酯后使刺激分泌的作用增强,但与gsp癌基因亦无关.结论 蛋白激酶C可能参与垂体腺瘤激素分泌的调控.
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nPKC和cPKC调节骨骼肌葡萄糖转运体4型转位的研究
目的:探讨新颖型蛋白激酶C(nPKC)和传统型蛋白激酶C(cPKC)调节骨骼肌葡萄糖转运体4型(GLUT4)转位的作用.方法:C2C12GLUT4myc肌管分为Basal组、PMA组(PMA孵育)、Go6983+PMA组(Go6983预孵育,再与PMA共孵育)、G06976+PMA组(G06976预孵育,再与PMA共孵育)、PMA24 h+PMA组(PMA预孵育24 h后,PMA孵育)和PMA24 h+Go6976+PMA组(PMA预孵育24 h,Go6976预孵育后,Go6976和PMA共孵育),应用吸光度分析法测定细胞表面的GLUT4myc水平.结果:与Basal组相比,PMA组、G06976+PMA组、PMA24 h+PMA组细胞表面GLUT4myc转位明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),与PMA组相比,G06983+PMA组、G06976+PMA组、PMA24 h+PMA组和PMA24 h+Go6976+PMA组细胞表面GLUT4myc转位明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:PMA激活PKC,增强骨骼肌GLUT4转位;抑制nPKC或cPKC的活性可降低PMA刺激的骨骼肌GLUT4转位;激活nPKC或cPKC可调节骨骼肌GLUT4转位.
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右美托咪定对痛觉过敏大鼠脊髓PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα表达的影响
目的：探讨右美托咪定对切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓蛋白激酶C（PKC）γ、钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）Ⅱα及pCaMKⅡα表达的影响。方法雄性SD大鼠40只，体质量240~260 g，2~3月龄，随机数字表法分为5组（n=8）：空白对照组（C组）、瑞芬太尼+切口痛组（R+I组）、右美托咪定+瑞芬太尼+切口痛组（D+R+I组）、右美托咪定+瑞芬太尼+切口痛+佛波醇酯+二甲基亚砜组（D+R+I+P+DMSO组）、右美托咪定+瑞芬太尼+切口痛+二甲基亚砜组（D+R+I+DMSO组）。采用足底切口的方法制备切口痛模型。瑞芬太尼以1.2μg·kg-1·min-1的速度经尾静脉输注90 min；右美托咪定以50μg/kg的剂量于术前30 min皮下注射；佛波醇酯及二甲基亚砜均为鞘内注射10μL。分别于输注前24 h（T0）、输注后2、6、24和48 h（T1~4）时测定热刺激缩足潜伏期（PWL）和机械刺激缩足阈值（PWT）。后1次行为学测试后处死大鼠，取脊髓L4~6节段。采用Western blot法测定脊髓背角PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα的表达。结果除T0外，与C组比较，其余各组PWL缩短、PWT降低，PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα表达上调。与R+I组比较，D+R+I组、D+R+I+DMSO组PWL延长、PWT升高，PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα表达下调。与D+R+I组比较，D+R+I+P+DMSO组PWL缩短、PWT降低，PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα表达上调。与D+R+I+P+DMSO组比较，D+R+I+DMSO组PWL延长、PWT升高，PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα表达下调。结论右美托咪定可以减少切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PKCγ、CaMKⅡα及pCaMKⅡα的表达。
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两段法培养适合临床移植应用的黑素细胞的安全性研究
目的:探讨使用两段法培养黑素细胞,以消除佛波醇酯(TPA)的致瘤危险,增加培养细胞的安全性,从而适合临床移植的需要.方法:两段法培养黑素细胞:先用含TPA培养液培养纯化黑素细胞,然后用不含TPA的培养基继续扩增传代.通过细胞形态、生长特性、细胞周期等检测观察有无TPA时培养细胞的特性.接种裸鼠检测培养细胞的致瘤性.结果:用含TPA培养液容易获得纯化的黑素细胞;扩增传代时改用不含TPA的培养基,黑素细胞由细长的多分支逐渐变成两极的宽梭形.生长速度略微减慢,细胞周期显示增殖减缓.裸鼠致瘤实验阴性.结论:两段法培养黑细胞成功率高,和以往培养基中含TPA的培养方法相比,所培养黑素细胞形状变化明显,生长减慢,用于临床移植时更加安全.
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佛波醇脂和溴脱氧尿嘧啶核苷促进鼻咽癌细胞中CD133的表达
目的:了解促癌剂佛波醇酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)和非放射性标记物溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)对鼻咽癌细胞5-8F中CD133表达的影响.方法:BrdU、TPA单独作用和Brdu+TPA联合作用处理鼻咽癌细胞株5-8F,不同药物处理组细胞采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR, RFQ-PCR)及Western印迹法检测CD133基因mRNA和蛋白水平的表达,FCM法分离并观察CD133~+细胞含量的变化,Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化.结果:与未处理组细胞相比, BrdU单独作用组和BrdU+TPA联合作用组细胞的CD133 mRNA表达量都有不同程度升高(P值分别为0.037和0.003),TPA单独作用组的CD133 mRNA表达量则降低;Western印迹法检测结果提示,3组药物处理组细胞CD133蛋白的表达量均增高;FCM法检测结果显示,CD133~+细胞的含量增加;细胞侵袭能力增强,以BrdU+TPA联合作用组效果显著.结论:在鼻咽癌细胞中,TPA和BrdU均能提高CD133蛋白的表达,并且有相互协同作用.
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PMA和PD98059对全反式维甲酸抑制HepG2细胞表达OPN的影响
目的 研究佛波醇酯(PMA)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)抑制剂PD98059对全反式维甲酸(ATRA)体外抑制人肝癌细胞株(HepG2)表达骨桥蛋白(OPN)的影响及其机制的初步探讨.方法 PMA、PD98059分别处理经ATRA处理的肝癌细胞HepG2,光镜下观察细胞形态,Western blot检测骨桥蛋白(OPN)、ERK1/2表达及其磷酸化变化,Image Pro软件分析各条带灰度值变化并做统计学分析.结果 在ATRA显著抑制肝癌细胞表达OPN并诱导细胞分化的基础上,PMA可刺激OPN表达,这种作用可被PD98059明显抑制.结论 激活ERK1/2通路可逆转ATRA抑制HepG2表达OPN的作用.
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斯伐他汀对佛波酯诱导的人肾小球系膜细胞A型清道夫受体表达的作用
目的观察斯伐他汀(Simv)对佛波酯(PMA)诱导的人肾小球系膜细胞(HMC)A型清道夫受体(SR-A)表达的作用.方法激光共聚焦显微镜检测HMC对荧光Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取.RT-PGR法检测HMC SR-A mRNA表达.瞬时转染带有SR-A启动子片段的荧光素报告质粒,观察斯伐他汀对HMC SR-A启动子活性的影响.结果(1)斯伐他汀(10 μmol/L)明显抑制PMA(16.2 nmol/L)诱导的HMC对Dil-ac-LDL的摄取,100 μmol/L甲羟戊酸(Mev)基本阻断斯伐他汀的抑制作用.(2)斯伐他汀作用48 h,剂量依赖性(1～10μmol/L)抑制PMA诱导的HMC SR-A mRNA表达,10 μmol/L组HMC SR-A mRNA表达量为对照组的54.7%:Mev可部分逆转斯伐他汀对SR-A mRNA的作用.(3)斯伐他汀抑制PMA诱导的HMC SR-A启动子活性,处理组与对照组荧光素酶活性相比,差异具有统计学意义(P＜0.01);斯伐他汀加甲羟戊酸组荧光酶活性与对照组相比,无显著性差异.(4)斯伐他汀直接抑制转染SR-A cDNA的人肾小球系膜细胞系SR-A mRNA表达.结论(1)斯伐他汀抑制HMC SR-A基因表达和活性可能为其延缓慢性肾小球疾病进展的机制之一;(2)斯伐他汀通过抑制甲羟戊酸代谢途径而抑制HMC SR-A的表达.
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流式细胞术检测大鼠Th1/Th2细胞的刺激方案研究
目的 探讨流式细胞术检测大鼠Th1/Th2细胞时使用刺激剂的佳方案.方法用不同浓度佛波酯(PMA)联合不同浓度离子霉素(Ion)作为激活剂,刺激大鼠外周血T淋巴细胞,采用流式细胞仪三色法方案,观察和分析在不同浓度组合的激活剂刺激下检测T淋巴细胞内干扰素-γ(INF-γ)、白介素-4(IL-4)的分泌效果.结果PMA浓度为25 ng/mL时,联合浓度分别为0、2、5、10、15、20 μg/mL的Ion刺激大鼠淋巴细胞,胞内IFN-γ/IL-4的表达阳性率分别为(1.19±0.26)%/(2.46±0.32)%、(1.23±0.21)%/(2.56±0.86)%、(3.08±0.56)%/(12.01±2.01)%、(4.01±0.48)%/(9.80±1.80)%、(3.98±1.78)%/(11.85±4.83)%、(3.76±1.08)%/(10.78±2.35)%.结论选用工作浓度为5～10 μg/mL的Ion联合工作浓度为25 ng/mL的PMA刺激培养大鼠淋巴细胞即可起到较好的激活作用,而且不会带来如CD4细胞下调、流式细胞术设门难度增加等干扰因素.在该浓度下,CD3/CD8和CD4两种设门方案均可用于大鼠Th1/Th2细胞检测.
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PBK/TOPK在TPA诱导的人HL-60细胞分化中的表达及意义
目的:研究PBK/TOPK在TPA(佛波酯)诱导白血病细胞HL-60的分化时的表达及意义.方法:细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;流式细胞仪检测药物对HL-60细胞周期及细胞表面分化抗原CD11b,CD14,CD13和CD33表达的影响;用western Blot法检测PBK/TOPK在HL-60细胞分化前后表达的变化.结果:经5.1 nmol/L TPA处理72 h后,NBT阳性细胞数和CD11b,CD13,CD14表达是增加的,HL-60细胞体积缩小,核浆比例减低,核仁减少甚至消失,核形态扭曲折迭或分叶;PBK/TOPK在HL-60细胞向成熟分化后表达下调.结论:TPA能抑制白血病细胞HL-60的增殖,并诱导其向成熟单核、粒细胞分化,在此过程中,PBK/TOPK表达是下调的,但Pho-PBK/TOPK的表达是增加的.
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建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化
目的:建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型,并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化.方法:无菌条件下取出生2 d大鼠的椭圆囊上皮,体外培养1～7 d;从第2日开始用倒置显微镜观察、照相,试验组加入PMA 30 min,2 h和6 h,固定,透射电镜观察.结果:体外培养椭圆囊1 wk,12 h时可见成纤维细胞沿移植物边缘游出,2 d后内皮细胞聚集,呈铺路石样,透射电镜观察细胞无肿胀,胞膜、胞核完整,线粒体嵴无肿胀,纤毛无脱落;PMA各试验组细胞形态正常,核糖体密集,高尔基体较前发达,内质网轻度扩张.结论:大鼠前庭器官体外培养方法可行,为今后进一步研究提供了实验模型.
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罗格列酮抑制NE和PMA诱发心肌肥大的研究
目的:研究罗格列酮(RSG)抑制去甲肾上腺素(NE)诱导的心肌肥大与蛋白激酶C(PKC),C-fos之间的关系.方法:在培养新生大鼠心肌细胞中,采用RSG,PKC的激动剂佛波醇酯(PMA),NE和PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(the)观察罗格列酮在NE和PMA诱导心肌肥大中对PKC活性和c-fos的影响.结果:PMA和NE均可促进心肌细胞蛋白质的合成和3H-亮氨酸的掺入,并可增强心肌细胞PKC活性,同时使PKC从胞质移位到细胞膜,RSG和ehe均有抑制蛋白质合成和3H-亮氨酸掺入的作用,还有抑制心肌细胞PKC活性的作用,RSG和che还可抑制NE增加c-fos蛋白的表达.结论:RSG抑制NE引起心肌肥大与PKC和c-fos有关.
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白藜芦醇对U937细胞基质金属蛋白酶-9转录的抑制作用
目的:观察白藜芦醇对佛波酯诱导的U937细胞中基质金属蛋白酶-9活性的影响,并从蛋白、mRNA及核转录因子激活蛋白-1(AP-1)水平对其影响进行分析.方法:酶谱法测定U937细胞培养上清中MMP-9的活性;Western blot法考察MMP-9蛋白的生成;RT-PCR法检测MMP-9 mRNA的表达;电泳迁移率变动分析法(EMSA)研究核转录因子AP-1的活性.结果:PMA 10 nmol/L可显著诱导无血清培养的U937细胞中MMP-9活性(P＜0.01);白藜芦醇在1和10 μmol/L浓度下可抑制PMA 10 nmol/L诱导的MMP-9活性(P＜0.05和P＜0.01);PMA 10 nmol/L可显著诱导U937细胞中MMP-9蛋白生成(P＜0.01)和MMP-9 mRNA的表达(P＜0.01),白藜芦醇在l、10 μmol/L浓度下可抑制PMA l0 nmol/L诱导的MMP-9蛋白生成和MMP-9 mRNA的表达(P＜0.05);白藜芦醇在10、1和0.1 μmol/L浓度下可抑制PMA诱导的U937细胞中AP-1的活化.结论:白藜芦醇可有效地抑制PMA诱导的U937细胞中MMP-9的活性,其作用可能是通过抑制PMA诱导的U937细胞核转录因子AP-1活化,进而降低MMP-9 mRNA表达,减少MMP-9蛋白生成而实现的.
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佛波醇酯对HeLa细胞Ha-ras基因启动子活性的影响
目的:研究佛波醇酯(PMA)对HeLa细胞Ha-fas基因启动子活性的影响.方法:利用MTT法检测PMA对HeLa细胞生长速率的影响,并通过逆转录聚合酶链反应法测定HeLa细胞Ha-ras基因表达水平,进一步将Ha-ras基因上游调控序列插入到不含启动子元件的EYFP基因的上游,构建了重组质粒pRasEYFP,并将其瞬时转染到HeLa细胞中.以EYFP作为报告基因分析了PMA长期处理对Ha-ras基因启动子活性的影响.在此基础上对PMA处理的HeLa细胞中蛋白激酶C(PKC)的活性进行了检测.结果:与未处理细胞相比,PMA长期处理引起HeLa细胞生长速率明显降低.经PMA处理(100μg/L)48小时和72小时,与未处理细胞相比HeLa细胞中Ha-ras基因的表达降低,Ha-ras基因启动子活性分别下降了34.0%和26.7%,同时PKC的活性分别降低了76.3%和73.2%.结论:PMA在Ha-ras基因启动子活性的调节中扮演着重要的角色.其作用的机理可能与PKC信号通路有关.
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佛波醇酯对MES23.5细胞铁调节蛋白1表达的影响
目的 探讨蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波醇酯(PMA)对MES 23.5细胞中铁调节蛋白1(IRP1)的激活作用.方法 采用MTT法观察细胞的存活率,Western Blot法检测IRP1和铁转出蛋白(Fpn1)的表达变化.结果 0.01～2.00μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,细胞存活率无明显变化(F=3.050,P＞0.05).0.20μmol/L的PMA作用MES 23.5细胞24 h后,IRP1表达明显上调(t=4.501,P＜0.01),Fpn1表达明显下调(t=5.174,P＜0.01).结论 PMA在多巴胺能神经细胞系MES 23.5细胞中能明显激活IRP1.
