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HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定
预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体.应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体.软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1∶105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1 B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP -Vpr融合蛋白.利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性.
关键词： HIV-1辅助蛋白Vpr B细胞表位 表位预测 多肽抗体 -
人C5a B细胞表位的设计与其单克隆抗体的结合
我们在分子设计的基础上,采用B细胞优势表位预测并结合实测的方法,设计合成人C5a的B细胞表位多肽,以此为抗原按常规方法免疫BALB/c小鼠,制作表位多肽单克隆抗体,在传统ELISA鉴定的基础上,利用生物传感器分析方法,分别研究单克隆抗体与表位多肽和全长C5a分子的结合动力学规律.
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人类肝素酶B细胞表位的预测和免疫原性鉴定
目的 预测并鉴定肝素酶(heparanase)蛋白B细胞表位免疫原性.方法 以肝素酶蛋白的氨基酸序列为基础,采用DNAStar分析软件以及Bcepred在线二级结构分析工具分析其蛋白二级结构并预测B细胞表位.根据预测结果 ,采用8分支多抗原肽结构合成针对该表位的抗原肽,将后者与通用型T辅助表位人IL-1β线性短肽(VQGEESNDK,氨基酸163～171)联合免疫日本白毛黑眼兔,检测免疫血清效价,鉴定其特异性和免疫原性.结果 软件预测显示,肝素酶蛋白大亚基的第1～15位(MAP1)、第279～293位(MAP2)及175～189位(MAP3)氨基酸序列可能为其优势B细胞表位.间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹及免疫组化分析,证实MAP1、MAP2及MAP3均能诱导机体产生高滴度抗体,但仅MAP1、MAP2抗体具有高特异性,MAP2抗体与肝癌组织的结合力强.结论 肝素酶大亚基的第1～15位、第279～293位氨基酸为其优势B细胞表位,其中第279～293位氨基酸的免疫原性强,这为肝素酶多肽抗体及B细胞优势短肽疫苗研制提供了理论依据.
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人端粒酶逆转录酶抗原HLA-A0201限制性CTL表位预测及鉴定
目的 应用生物信息学方法对人端粒酶逆转录酶(hTERT) HLA-A2+限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位进行预测和鉴定,寻找诱导机体特异性杀伤肺癌肿瘤细胞的抗原表位.方法 应用生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI对hTERT蛋白进行HLA-A0201限制性CTL抗原表位预测,筛选优势表位;应用肽亲和力实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验及人干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT实验验证表位,筛选出激发机体产生特异性免疫反应的表位.结果 生物信息学软件筛选出优势表位为:ILAKFLHWL、ELLRSFFYV及ILSTLLCSL;肽亲和力实验得到优势表位荧光系数(FI)为:ILAKFLHWL0.67、ELLRSFFYV0.66及ILSTLLCSL0.90;LDH释放实验显示ILAKFLHWL所诱导CTLs的杀伤率明显高于其它各表位,也明显高于阴性表位,差异均具有统计学意义(P＜0.05);人IFN-γ ELISPOT实验证明ILAKFLHWL所诱导的CTLs产生的IFN-γ斑点数多于其他表位,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 ILAKFLHWL的免疫原性强,可用于后续制备肺癌多肽疫苗.
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宁夏人细粒棘球蚴延伸因子-1重组蛋白特性分析及抗原表位预测
目的分析宁夏人Eg.EF-1重组蛋白的氨基酸序列,了解该蛋白的特性,预测其抗原表位,为进一步研究多肽疫苗提供理论依据.方法克隆Eg.EF-1基因片段并测序,重组入Eg.EF-1/pGEX-6P-1载体表达重组蛋白Eg.EF-1并鉴定其免疫学活性,利用生物信息学方法推测Eg.EF-1重组蛋白质的氨基酸序列、分析Eg.EF-1重组蛋白特性及二级结构、在线预测重组蛋白三维图象数据并将其结果用Anthe_5_0和spdbv37sp5软件模拟该蛋白三维结构,对Eg.EF-1重组蛋白氨基酸序列进行BLAST同源性比对分析,用DNAStar/Protean、BIOSUN软件和HLA Ligand/Motif网上B细胞抗原表位预测数据库对蛋白抗原表位进行预测.结果 Eg.EF-1基因开放阅读框编码一个由230个氨基酸残基组成的多肽,同源性分析发现,重组蛋白氨基酸序列与数据库中收录的意大利细粒棘球蚴延伸因子EF-1的氨基酸序列有98%的同源性;蛋白特性分析显示Eg.EF-1重组蛋白是疏水性极强的酸性蛋白,含有较多的α螺旋结构;3种软件综合分析结果预测,Eg.EF-1基因重组蛋白抗原表位位置为20～26(SATEQKG)、50～56(SWNERME)、176～185(LWGTSKLVPL)、199～205(VENDKVG)、217～229(ELEDYVQSVDVAS)5个氨基酸肽段.结论 Eg.EF-1重组蛋白可能是人细粒棘球蚴延伸因子-1相关蛋白,根据3种生物信息学工具预测的抗原表位是研究多肽疫苗时合成肽段的参考依据.
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猴B病毒囊膜蛋白gD的B细胞表位预测及鉴定
目的：鉴定猴B病毒囊膜蛋白gD的抗原表位。方法利用生物信息学分析猴B病毒囊膜蛋白gD的二级结构、亲水性、表面可及性、抗原性指数以及柔韧性，得到可能的表位肽段；再利用合成肽与B病毒阳性血清进行ELISA验证，评价表位肽段的特异性和敏感性。结果在gD蛋白上预测得到7个表位肽段；ELISA测定结果显示，4个肽段（序列分别为46 LPPLEQKTD54、106 RGAPEATRSDA116、291 PELAPEERGTSRTPGD306和361 AVYLVRRRGR370）可与B病毒阳性血清发生免疫学反应，敏感性在40％～70％之间。结论 B病毒gD蛋白上至少存在4个线性化表位。
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SARS CoV抗原决定簇的预测和制备
目的获得严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)中和性抗原蛋白.方法使用Blast工具将SARSS蛋白的氨基酸序列与其他蛋白进行比对分析.冠状病毒鼠肝炎病毒的刺突蛋白在S2段存在中和性抗体表位.通过对鼠肝炎病毒和SARS CoVS2的氨基酸序列分析,SARS CoV的S2段类似于鼠肝炎病毒的S2段.使用DNASTAR软件对2段的相似性进行分析.选取SARS CoVS2蛋白基因在大肠埃希菌中进行表达.表达产物进行免疫印迹分析.结果在SARS刺突蛋白C端发现了与其他冠状病毒S2蛋白具有较高的同源性的片段.在SARS病毒刺突蛋白的S2段可能存在中和性表位.将该肽段在大肠埃希菌中获得表达.表达的蛋白片段可以和来自SARS恢复期的人抗SARS-CoV免疫球蛋白特异性结合.结论表达的蛋白片段有可能成为预防SARS的候选疫苗.
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人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体增效作用研究
目的:研究人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体的增效作用.方法:将C-57BL/6小鼠随机分为对照组、MAP组、人参总皂苷组,MAP组在预测MAGE-12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82-93)的基础上,采用4分枝多重抗原肽结构设计合成抗原肽,免疫C-57BL/6小鼠,产生多克隆抗体,应用ELISA实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体.人参总皂苷组在MAP抗原肽免疫小鼠的同时,人参总皂苷灌胃给药,0.2mL/20g,每日1次.结果:免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体,且人参总皂苷组抗体效价高于MAP组,达1∶256.结论:人参总皂苷对MAGE-12的B细胞表位抗体有增效作用.
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抗原表位预测的免疫信息学方法研究进展
表位是抗原分子中由特殊的化学基团组成的结构,根据与抗原受体结合的不同可分为B细胞表位和T细胞表位.B细胞表位是抗原中可被B细胞抗原受体或抗体特异性识别并结合的线性片段或空间构象性结构.B细胞表位只有很少的一部分是线性表位,而绝大部分(约90%)是构象性表位.
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Trim22B细胞表位预测及多克隆抗体制备与鉴定
目的:预测人Trim22的B细胞抗原表位,制备并鉴定其多克隆抗体.方法:利用生物信息学软件分析Trim22的氨基酸序列,确定抗原表位并人工合成多肽.将合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫大白兔制备抗Trim22的抗体.经饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并对抗体进行ELISA、Western blot鉴定.结果:获得抗Trim22的多克隆抗体,抗体效价为1∶16 000,该抗体能特异性地识别包含(382～397)区段的Trim22缺失突变体,同时该抗体不能识别Trim22旁系同源分子Trim5α、Trim6和Trim34α.结论:采用人工合成多肽作为半抗原制备出抗Trim22的多克隆抗体,对研究内源性Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用机制具有重要价值.
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SPR技术在免疫学研究中的应用
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术是研究生物分子相互作用的强有力工具之一,该技术使生物分子之间相互作用的实时检测成为可能,并且灵敏度高、无需标记.通过分析传感图谱及分子相互作用的响应值获取分子相互作用的模式和动力学常数等方面的信息,并且获得的信息是能够定性和定量.SPR技术现在已广泛应用于生物、化学、免疫学研究及新药开发等领域.本文主要就SPR技术在免疫学研究中抗体活性检测、抗原表位预测等方面的应用进行了综述.
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辅助T细胞表位预测及其在抗寄生虫疫苗研发中的应用
细胞免疫在防御外来病原感染、自身免疫及肿瘤等疾病中发挥重要作用.随着分子免疫学研究的不断发展,对T淋巴细胞免疫分子机制的阐释,大量T细胞表位信息以及功能基因组学资料的积累,使得基于数据驱动的预测T细胞表位的研究受到重视,可能成为疫苗研发的重要工具之一.本文概述辅助T细胞表位预测的理论和方法及其在寄生虫疫苗研发中的应用,并讨论未来的研究方向.
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新型结核抗原肽的鉴定及在人免疫缺陷病毒感染人群结核诊断中的应用价值
目的 筛选并验证主要组织相容性复合物-Ⅰ (MHC-Ⅰ)限制性结核抗原肽作为结核感染γ干扰素释放测定(IGRA)试剂在HIV感染人群结核诊断中的临床应用价值.方法 以RD区编码蛋白为候选抗原,利用计算机软件预测与HIV感染人群MHC-Ⅰ高频分子高度亲和的CD8+T淋巴细胞表位,人工合成含有CD8+T淋巴细胞表位的多肽进行体外筛选试验,用筛选所得混合多肽池为IGRA试剂,与相对分子质量为6 000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相对分子质量为10 000的培养滤液蛋白(CFP-10)比较,在HIV感染人群中的灵敏度和特异度.结果 终获得8个重叠多肽池,Rv0222176-191、Rv1980c122-138、Rv1985c105-120、Rv3425141-165、Rv3873133-151、Rv3873158-166、Rv387878 86和Rv3879c673-690,可刺激结核患者外周血CD8+T淋巴细胞产生γ干扰素,但对健康对照PBMC无刺激效应.在检测25例结核分枝杆菌合并HIV感染者血样时,由这8个重叠多肽池混合而成的IGRA刺激剂(CP)的灵敏度与rESAT 6/CFP10 (CE)的灵敏度均较低(68％比48％,x2=2.052,P=0.152),但二者共同作为IGRA刺激剂(CP+CE)时灵敏度达92％,显著高于rESAT6/CFP10(x2=11.523,P＜0.01),且不影响特异度.结论 筛选出来的含CD8表位的RD区合成肽可提高IGRA试剂盒检测HIV感染/艾滋病患者的灵敏度,进而提高该人群的结核病检出率.
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结核潜伏感染蛋白Rv1737c B细胞、CTL及Th表位预测与分析
目的 利用生物信息学方法建立一套预测B细胞、CTL及Th细胞免疫功能多肽的方法,用于筛选新型结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原.方法 采用DNAStar软件包中的Protean软件从α螺旋、β折叠及转角等二级结构的数量和分布、亲水性和表面可及性等方面预测分析该蛋白序列成为B细胞表位的可能性,预测CTL表位时,先采用Blast方法分析该序列与人类序列的同源性,然后综合应用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL预测其CTL表位,应用RANKPEP及SYFPEITHI超基序法远程预测Th细胞表位,筛选表位集中、分值较高者作为候选多肽片段.结果 Protean软件预测结果表明Rv1737c蛋白序列亲水性和表面可及性都较弱,α转角、β折叠结构数目较多且分布广泛,而转角及卷曲结构较少,B细胞表位数目较少;Rv1737c蛋白的CTL及Th表位主要集中于第100位氨基酸之后,其中与HLA-A2表型相对的CTL表位,与HLA-DRB1 * 0401及HLA-DRB1* 1501表型相对的Th表位较其他表型数目较多、分值较高.结论 Rv1737c蛋白可能不利于作为B细胞抗原,但其可能是一种较好的T细胞抗原,成为结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原.
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针对癌睾抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的长肽疫苗设计及其免疫活性检测
目的:设计针对癌睾抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的长肽,并检测其免疫活性.方法:利用在线数据库预测PLAC1、PL2L60、MAGE-3的CTL表位,在表位集中区域选取适当长度的长肽,化学合成并纯化后,通过体外和体内活性实验验证长肽是否具有免疫活性.结果:针对PLAC1、PL2L60、MAGE-3预测出HLA-A2限制性CTL表位并设计出7条长肽.体外自提呈、DC荷肽的ELISPOT结果和体外LDH结果显示,PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE3-P152-175等4条长肽具有较好的免疫活性;体内ELISA结果显示MAGE-3 P152-175在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠中诱导了较多的IFN-γ释放,体内LDH结果显示PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175等4条长肽所诱导的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠脾淋巴细胞对靶细胞具有较高的杀伤率.结论:成功筛选鉴定出针对癌睾抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的4条长肽,可用作免疫治疗疫苗.
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结核分枝杆菌耐药相关药物外排抗原HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测
目的:预测结核分枝杆菌( MTB)耐药相关药物外排抗原(Rv1634、Rv2846c、Rv2937、Rv2686c、Rv2687c 及Rv3065)的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:通过NCBI数据库获取目的蛋白的氨基酸序列,运用BLAST分析它们与人类蛋白的同源性,利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL数据库软件预测HLA-A2限制性CTL表位.结果与结论:预测筛选出6个候选抗原的21个HLA-A2限制性CTL优势表位.
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结核杆菌抗原CFP21/MTB12/Rv3881 C的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测
目的:预测结核杆菌分泌抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL方法预测分析抗原CFP21/MTBl2/Rv3881c的HLA-A*0201限制性CTL表位,进一步运用NetCTL方法对抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA-A其他等位基因和HLA-B限制性CTL表位进行预测分析.结果:初步筛选出3个候选抗原HLA-A*0201限制性CTL优势表位各4条,分别为CFP21 5-13、13-21、134-142、189-197;MTB12 26-34、36-44、40-48、61-69;Rv3881c 204-212、207-215、234-242、260-268.得到3个候选抗原HLA-A3和HLA-B7限制性CTL优势表位共21条.结论:初步筛选出抗原CFP21/MTB12/Rv3881c潜在的HLA-A*0201、HLA-A3、HLA-B7限制性表位33条.
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乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因定点诱变
目的定点诱变热休克蛋白-乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因中编码半胱氨酸的密码子,解决下游纯化工作中产生多聚体蛋白的问题.方法在对蛋白质序列进行计算机表位预测及生物学特性分析的基础上,利用PCR的定点诱变技术,使原始基因序列中编码半胱氨酸的TGC突变为编码甘氨酸的GGC,克隆并表达了该基因编码的蛋白质.结果经克隆、测序后证实已成功获得突变基因,其编码的融合蛋白经纯化后没有多聚体的产生.结论利用PCR定点诱变技术对基因进行突变,在不改变蛋白质抗原性质的基础上,优化蛋白质序列,提高蛋白质纯化质量和效率.
关键词： 乳头瘤病毒表位融合基因 定点诱变 表位预测 蛋白质纯化 -
抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的研制及其检测试剂的初步应用
目的 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在国际上已成为临床诊断急性肾损伤(AKI)的主要生物标志物.该课题主要研制抗人NGAL单抗及探讨其国产化诊断试剂的初步应用.方法 预测NGAL抗原表位并结合NGAL的晶体结构,设计合成抗原表位肽并与血蓝蛋白偶联,免疫小鼠制备抗NGAL单抗;人工合成NGAL基因构建原核表达载体pET-DsbA-NGAL,诱导表达后分离纯化重组NGAL蛋白,研制NGAL标准品;建立双单抗体夹心ELISA法,检测该方法的线性范围、检测限、灵敏度和精密度,同时检测20份健康对照组和20份AKI患者血清和尿液样品.结果 针对NGAL两个表位(21-34aa;58-71aa)分别获得了4株和3株能够稳定分泌抗NGAL单抗的细胞株;ELISA法低检出限为0.25 ng/ml,标准曲线在2.5～125.0 ng/ml范围内线性良好,批间变异CV值均小于10％;冻干NGAL标准品在4℃稳定达6个月;AKI组血清和尿液中NGAL含量分别为(589.5±75.5)和(89.4±12.4)ng/ml,而健康对照组血清和尿液中NGAL含量分别为(58.8±9.5)和(7.2±1.4)ng/ml;两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 该研究获得了抗人NGAL单抗及其基因工程NGAL标准品并建立了ELISA定量检测试剂,为实现NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化提供了良好的技术基础.
关键词： 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 单克隆抗体 ELISA 表位预测 急性肾损伤 -
结核潜伏感染蛋白Rv2657c T细胞和B细胞表位的预测与分析
目的：预测结核分枝杆菌Rv2657c蛋白的抗原表位，了解其免疫原性。方法：应用DNAStar软件预测Rv2657c蛋白的T细胞和B细胞表位；Blast方法分析该蛋白氨基酸序列与人类蛋白序列的相似性；SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL法预测蛋白的CTL表位；RANKPEP及SYFPEITHI超基序法远程预测Th细胞表位。结果：DNAStar软件预测Rv2657c蛋白有5个B细胞抗原表位，6个T细胞抗原表位。SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL法预测该蛋白有6个CTL表位；RANKPEP及SYFPEITHI超基序法预测该蛋白有38个Th表位。结论：Rv2657c蛋白既有B细胞表位也有T细胞表位，可能成为结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。
