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实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较
目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.
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实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应鉴定脊髓灰质炎病毒方法的评估
目的 在中国脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络[Poliovirus(PV)Laboratory Network,PLN]中,首次应用实时荧光定量逆转录.聚合酶链反应(Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,rRT-PCR)对PV进行鉴定,并对该方法进行应用评估.方法 采用世界卫生组织(WHO)推荐的、美国疾病控制与预防中心研发的rRT-PCR法.对中国PLN既往分离的10株PV进行型内鉴定(Intratypie Differentiation,ITD)和疫苗衍生PV(Vaccine-derived PV,VDPVs)筛选,并将检测结果与毒株的VP1编码区核苷酸序列测定结果进行比较分析.结果 10株PV rRT-PCR的结果与VP1编码区核苷酸序列测定结果不能完全相符,rRT-PCR无法鉴别10株PV中的5株Pre(前)-VDPVs,并且漏检了山西省2007年发现的1株I型VDPV.结论 作为WHO推荐使用的新型ITD方法,rRT-PCR法是否适用于中国PLN,还有待大样本PV rRT-PCR法的四顾性和前瞻性研究.
关键词： 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 脊髓灰质炎病毒 型内鉴定 -
实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较
目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份，χ2=8.1， P<0.005。结论通过该实验，验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。
关键词： 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 细胞培养法 流感病毒 -
六味地黄汤及其拆方对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞分化相关基因表达的影响
目的:研究六味地黄汤及其"三补(SB)"、"三泻(SX)"拆方对正常小鼠和快速老化模型小鼠(SAMP8)胸腺淋巴细胞分化相关的Notch信号转导通路基因表达的影响.方法:以荧光实时定量PCR方法检测Notch1、PS1、PS2、HES1等基因表达的变化.结果:口服LW(5、10、20 s/kg)可明显促进正常小鼠胸腺细胞PS2、HES1基因的表达;口服LW(10g/kg)及其SB、SX拆方,可不同程度地降低SAMP8的PS2、HES1基因表达水平.结论:LW可增强正常的小鼠胸腺细胞Notch信号强度;对免疫老化的SAMP8,LW能够降低胸腺细胞Notch信号强度.
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实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应型内鉴定脊髓灰质炎病毒方法的应用
2011年新疆发生输入性脊灰野病毒的疫情后,为了缩短检测时限,中国决定从2013年起启用WHO推荐的《脊髓灰质炎病毒分离新的检测流程》,要求省级脊灰实验室经过培训考核,使用美国CDC研制的实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)试剂和方法[1],对分离出的脊灰病毒(PV)培养物进行型内鉴定(ITD).
关键词： 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 脊髓灰质炎病毒 型内鉴定 -
Ⅲ型胶原α链基因mRNA的表达与舌苔形成的关系研究
目的 研究Ⅲ型胶原α链基因表达水平与舌苔形成之间的关系.方法应用基因芯片技术和实时荧光定量逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测Ⅲ型胶原α链在不同舌苔中的表达水平.结果基因芯片显示,常见舌苔中Ⅲ型胶原α链表达水平差异有统计学意义;实时荧光定量PCR证实从高到低依次为:黄厚苔》白薄苔》白厚苔》无苔》黄薄苔》胎儿白薄苔.结论常见舌苔中,Ⅲ型胶原α链表达水平有差异,提示Ⅲ型胶原α链基因表达水平的调控在舌苔形成过程中可能有一定的意义.
关键词： Ⅲ型胶原α链 舌苔 基因芯片 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
一氧化氮合酶抑制剂对大鼠耳蜗诱生型一氧化氮合酶mRNA表达的影响
目的 观察一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)抑制剂L-NAME(N-nitro-arginine methylester)对大鼠耳蜗新霉素诱导的NOS mRNA表达的影响.方法 将50只SD(Sprague-Dawley)大鼠分为3组:A组10只,肌肉注射注射用水2 mL,1次/d,共14 d;B组20只,肌肉注射新霉素,150 mr/kg体质量,1次/d,共14 d;C组20只,腹腔注射L-NAME,50 mg/kg体质量,30 min后肌肉注射新霉素,150 mg/kg体质量,1次/d,,共14 d.应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RTPCR)技术检测各组耳蜗顶圈、中圈、底圈诱生型NOS mRNA的表达,比较与A组相比,B组和C组诱生型NOS增高比例.结果 B组和C组顶圈诱生型NOS的表达增高比例分别为57.10±13.74和40.54±10.99,中圈分别为63.48±12.20和18.45±1.99,底圈分别为71.97±13.15和48.03士11.97,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 NOS抑制剂可以抑制新霉素诱导的耳蜗组织NOS mRNA的高表达,减轻此类抗生素的耳毒性.
关键词： 新霉素 诱生型一氧化氮合酶 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
rRT-PCR法在脊髓灰质炎病毒型内鉴定中的应用
目的 应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)对脊髓灰质炎病毒(PV)进行型内鉴定,并对该方法进行评估.方法 采用世界卫生组织(WHO)推荐的脊髓灰质炎ITD和VDPV rRT-PCR方法对江西省既往分离的14株脊髓灰质炎毒株和2013年分离的15株脊髓灰质炎毒株进行ITD和VDPVs筛选,并将检测结果与毒株的VP1编码区核苷酸序列测定结果进行比较分析.结果 ITD rRT-PCR的实验结果除1株毒株漏检外,其余与毒株的VP1编码区序列测定结果完全相符,VDPV rRT-PCR的结果与VP1编码区序列测定结果不完全相符,共有14株Ⅱ型脊髓灰质炎病毒疫苗类似株被错判为VDPV株,11株Ⅲ型VDPV株错判为疫苗类似株.结论 对脊髓灰质炎型内进行rRT-PCR鉴定的方法可以替代中和试验的常规检测方法,但不能完全取代测序技术用于脊髓灰质炎VDPV的鉴定.
关键词： 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 脊髓灰质炎病毒 型内鉴定 -
苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达和诱导红系分化
目的 研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达及红系分化作用.方法 不同水平苦参碱诱导K562细胞 6 d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa 染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量 RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因 mRNA 表达水平的变化.结果 K562 细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的 0.7%高可上升至 15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白 mRNA表达增加.结论 苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白 mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据.
关键词： 苦参碱 红系分化 γ珠蛋白基因 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
乙型流感病毒分子检测中质量控制的研究
目的 优化乙型流感暴发监测中分子鉴定的实验条件.方法 分别以病毒RNA提取试剂盒手工提取和全自动核酸提取工作站提取江苏省暴发标本RNA,采用实时荧光定量RT-PCR检测看家基因核糖核酸酶P(RNaseP)和乙型流感核蛋白(B-NP)基因;分别以本实验室建立的RT-PCR扩增体系和进口商品化RT-PCR扩增体系,对乙型流感基质蛋白(B-M)基因进行检测.结果 看家基因RNaseP能有效监测采样和RNA纯化的有效性;手工提取RNA的效率高于自动提取;进口商品化RT-PCR体系的扩增M基因效果较好.结论 以手工法提取RNA,以real-timeRT-PCR检测B-NP基因和以进口商品化RT-PCR扩增体系检测B-M基因,能相对客观地反映病毒流行现状.
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实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应脊灰型内鉴定新方法在脊灰实验室的应用
目的 在河北省脊髓灰质炎(脊灰)实验室首次应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,rRT-PCR)对脊灰病毒(PV)进行鉴定,并对该方法进行评估,为进行常规rRT-PCR型内鉴定方法做准备. 方法 采用世界卫生组织(WHO)推荐的rRT-PCR方法,对河北省既往分离的PV和WHO发放的PV株进行型内鉴定(intratypic differentiation,ITD)和疫苗衍生PV(vaccine-derived PV,VDPV)筛选. 结果 ITD rRT-PCR的实验结果与毒株的VP1编码区序列测定结果完全相符,VDPV rRT-PCR的结果与VP1编码区序列测定结果不能完全相符,有2株Ⅱ型脊灰病毒被错判为NSL,假阳性率为6.9％ (2/29). 结论 Real time PCR脊灰型内鉴定方法可以在河北省脊灰实验室用于脊灰病毒的常规监测.
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乳腺癌中Id3基因mRNA的表达及其与临床病理的关系
目的 观察乳腺癌组织中的分化/DNA结合抑制因子3(Id3)mRNA的表达情况,并探讨其与临床病理及其他分子指标的关系.方法 应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应对48例乳腺癌组织、20例乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌 MCF-7 细胞系中 Id3 mRNA 进行检测.以免疫组化 SABC 法检测 Id3 蛋白在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤组织中的表达及与乳腺癌中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的关系.结果 经实时荧光定量PCR法检测,乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织中的2-CT值分别为5.775 7±1.566 4、1.109 6±0.014 5.乳腺癌组织的 Id3 mRNA 阳性表达率均显著高于乳腺纤维腺瘤组织(P<0.05),Spearman等级相关分析表明其与VEGF表达呈正相关(rs=0.379,P=0.008),而与患者的年龄、淋巴结转移、肿块大小、组织学分级、pTNM 分期等临床病理因素无关(P＞0.05).结论 Id3 在乳腺癌中高表达,与 VEGF 表达呈正相关,可能与血管形成有关.
关键词： Id3基因 乳腺癌 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
rRT-PCR与微量中和实验法用于脊灰病毒血清定型的比较
目的 对实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PC R)法和微量中和实验2种脊灰病毒的血清型鉴定方法进行评价.方法 按世界卫生组织(WH0)《脊髓灰质炎实验室手册》第4版进行病毒分离,用rRT-PCR法和微量中和实验方法对分离到的L20B阳性分离物进行PV的血清型鉴定,用rRT-PCR法进行型内鉴定.结果 rRT-PCR法与微量中和实验对L20B阳性分离物进行脊灰病毒的血清型定型,2种方法检测脊灰病毒阳性率差异无统计学意义,检测NPEV阳性率差异也无统计学意义;rRT-PCR方法检测脊灰病毒的灵敏度为100％,特异度为100％;检测NPEV的灵敏度为63.16％,特异度为100％.结论 作为WHO推荐使用的新的型内鉴定方法,rRT-PCR法对于脊灰病毒的血清型定型与常规微量中和实验一致率为100％,该方法方便快捷,可以缩短检测时限;对于NPEV的检测特异度较高,但灵敏度低于微量中和实验.
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光子嫩肤术对大鼠皮肤胶原的影响
目的:研究光子嫩肤术(IPL)对大鼠皮肤Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其基因表达的影响,探讨IPL的作用机理.方法:选择24只SD大鼠,每只背部皮肤选左右2个部位,右侧对照,左侧用强脉冲光照射,按实验时间段分成1周、2周、4周、8周四组,在照射后分别切取实验及对照部位皮肤作组织学观察,包括HE染色、Masson胶原染色;用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PcR)法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达.结果:照射后1周、2周,两组皮肤的胶原含量无明显区别;照射4周、8周实验侧皮肤胶原纤维明显增多,同时,实验侧mRNA的表达在4周、8周均比对照侧增强(P＜0.05).结论:IPL能促进大鼠皮肤新生胶原的增生.
关键词： 光子嫩肤术 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 大鼠 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
氯胺酮对先天性心脏病患者心内直视手术下心肌热休克蛋白72 mRNA表达的影响
目的 研究人全心缺血再灌注时心肌热休克蛋白72(HSP72)mRNA的表达及氯胺酮预处理对其表达的影响,探讨氯胺酮心肌保护的机制.方法 选择择期行先天性房间隔缺损或室间隔缺损修补术的患者36人,随机分为3组(各12人):对照组(C组)、氯胺酮干预组(K1、K2组).在劈胸骨、主动脉插管时和主动脉开放前5 min,干预组分别静脉注射氯胺酮0.5、1.0mg/kg,对照组注射等量生理盐水.在上腔静脉插管时(T1)、主动脉阻断后30 min(T2)和主动脉开放后30 min(T3)取适量心肌组织,应用一步法实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应检测心肌中HSP72 mRNA的表达量.结果 组内比较HSP72mRNA表达量随着缺血再灌注损伤的发生和发展呈逐渐增加的趋势,各时间点比较差异有统计学意义(P＜0.05).组间比较除T1时间点外,HSP72 mRNA表达量在T2和T3时间点氯胺酮干预组均显著高于对照组(P＜0.05),K1、K2两组相比较差异无显著性(P＞0.05).结论 HSP72基因在心肌缺血再灌注损伤时表达增加.氯胺酮能显著促进心肌HSP72基因的表达,减少血浆心肌酶的漏出,具有心肌保护作用,且亚麻醉剂量与麻醉剂量效应相同.
关键词： 氯胺酮 热休克蛋白72 缺血再灌注 心肌 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 -
先天性心脏病患者在心内直视手术期间心肌热休克蛋白72 mRNA的表达
目的 观察体外循环期间心内直视手术中先天性心脏病患者心肌热休克蛋白72(HSP72)mRNA表达的变化,探讨HSP72在心肌缺血再灌注发生和发展中的作用.方法 24例择期行先天性房间隔缺损或室间隔缺损修补术的患者,在上腔静脉插管时(T1)、主动脉阻断后30 min(T2)和主动脉开放后30 min(T3)取适量心肌组织,应用一步法实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测心肌中HSP72mRNA的表达量.分别于T1、T2、T3和主动脉开放后2 h(T4)取上腔静脉血4 mL,检测肌酸激酶和心肌型肌酸激酶同工酶含量.结果 组内比较,HSP72 mRNA表达量在T2和T3时间点含量均高于T1时间点(P＜0.01),T3时间点高于T2时间点(P＜0.05).血清肌酸激酶和心肌型肌酸激酶同工酶含量从T1到T4呈增加趋势,各时间点相互比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 HSP72 mRNA在心肌缺血再灌注时表达增加,在一定程度上参与了心肌的缺血再灌注损伤.
