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分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗在小鼠体内的免疫效应
目的 研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应.方法 以2×106 CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD8+ T细胞亚群百分比;TB-PPD刺激后以MTT法测定淋巴细胞增殖程度,ELISA检测诱生IFN-γ和IL-10水平.结果 rBCG和BCG免疫组小鼠血清特异性抗体滴度分别达1∶5 120和1∶2 560,差异有统计学意义(q=3.89,P=0.034).rBCG组的IFN-γ水平在第8周达高(597.1 pg/ml),同期BCG组为416.7 pg/ml,差异有统计学意义(q=10.60,P<0.01).rBCG组IL-10水平第4周和第6周时也高于BCG组(P<0.05),第8周回落.除第6周外,rBCG组的淋巴细胞增殖指数都高于BCG组(P<0.05).第8周rBCG组和BCG组CD4+T亚群分别占(71.1±2.6)%和(62.3±2.0)%,差异有统计学意义(q=4.16,P=0.026);CD8+T亚群分别占(35.9±1.7)%和(26.9±2.8)%,差异有统计学意义(q=4.52,P=0.019).结论 融合蛋白Ag85B-ESAT-6引入BCG增强了其抗MTB反应.
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结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立
目的 原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体pGEX4T-1上.原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白.用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性.结果 扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物.超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多.将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别.结论 构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础.
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结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建
目的构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗.方法以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Ag85B编码基因,用限制性内切酶消化后,插入真核表达载体pVax1中,转化大肠杆菌DH5α,进行重组子筛选、鉴定.结果以结核分支杆菌PCR扩增为阳性,经限制性内切酶消化后可见目的条带,所测定序列与报道的Ag85B序列一致.结论成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株.
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Ag85 B 调节小鼠髓样树突状细胞的成熟和TSLP 介导下 TSLPR 和 OX40 L 的表达
目的：研究抗原85B（ Ag85B）体外诱导小鼠未成熟的髓样树突状细胞（ mDCs）的成熟以及对胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）介导下mDCs表达TSLP受体（TSLPR）和OX40L的影响，探究Ag85B抑制哮喘气道炎症的可能机制。方法：应用重组小鼠GM－CSF和IL－4体外诱生C57BL／6小鼠未成熟的mDCs，并运用免疫磁珠分离的方法纯化，采用光镜和扫描电镜、流式细胞术进行形态学观察和细胞表型鉴定；分别用0、50、100、200μg／L不同浓度的Ag85B或TSLP作用于纯化并鉴定后的mDCs，培养24 h，流式细胞术检测细胞表面分子CD80、CD86、TSL－PR和OX40L的表达，选取佳的Ag85B或TSLP处理浓度。随后将 mDCs随机分为空白对照组、Ag85B处理组、TSLP处理组和Ag85B＋TSLP处理组，培养24 h后检测mDCs的促炎表面分子TSLPR和OX40L的表达。结果：体外诱导培养7 d，倒置相差显微镜下可见细胞表面呈现不规则树突样突起，扫描电镜下见细胞类圆形，表面有少量皱褶和较少分叉的树突状突起，符合未成熟mDCs的形态学特点；纯化后的mDCs表达表面分子CD11c的细胞较表达共刺激分子CD80和CD86的细胞多，符合未成熟mDCs 的表型特征。与空白对照组比较，50～200μg／L的Ag85B处理组mDCs表达CD80和CD86的细胞比率显著增高（P＜0．05），表达TSLPR和OX40L的细胞比率无显著差异。与空白对照组相比较，50、100和200μg／L浓度的TSLP处理组的mDCs表达CD80和CD86的细胞比率均显著增加（ P＜0．05）；与空白对照组和50μg／L TSLP处理组相比较，100μg／L和200μg／L TSLP处理组的mDCs表达TSLPR和OX40L的细胞比率均显著升高（ P＜0．05）。选取200μg／L作为Ag85B和TSLP的优化作用浓度，结果发现Ag85B处理组和Ag85B＋TSLP处理组的mDCs表达TSLPR和OX40L的细胞比率较TSLP处理组均显著降低（ P＜0．05），与空白对照组比较差异不显著。结论：Ag85B可通过上调mDCs 表达共刺激分子CD80和CD86促进其成熟，同时下调TSLP介导的mDCs表达促炎表面分子TSLPR和OX40L，推测Ag85B可能通过TSLP介导的mDCs途径抑制气道炎症。
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力
目的: 研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力.方法: 采用皮下包埋的方法,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,用MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)作为抗原,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答,后一次免疫完成后4 wk,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞,体外用抗原刺激,MTT法检测淋巴细胞刺激反应,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果: Ag85B-ESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 1000,ESAT6-Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 5000. 融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为2.40±0.17 和2.60±0.25,而生理盐水组只有0.90±0.21;相对应的IFN-γ含量分别为(3.51±0.30) μg/L和(4.05±0.41) μg/L,显著高与生理盐水对照组(0.50±0.25) μg/L, P<0.05,但不及BCG免疫组(5.55±0.31) μg/L. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.31±0.13)相比较,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷分别为5.04±0.11和5.15±0.29, P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论: Ag85B与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
