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金黄色葡萄球菌IsdA蛋白B细胞线性抗原表位的预测与鉴定
目的 预测金黄色葡萄球球菌Newman株IsdA蛋白B细胞线性抗原表位,并对所预测B细胞表位的免疫反应性进行初步鉴定. 方法 以金黄色葡萄球球菌Newman株IsdA蛋白为对象,采用NCBI提供的蛋白质查询程序确定IsdA蛋白的氨基酸序列,然后使用网络在线预测软件SOPMA分析IsdA蛋白质二级结构;使用IEDB网络服务器预测IsdA蛋白B细胞线性表位和Th细胞表位;使用VectorNTI10.0软件分析IsdA蛋白序列中易形成B细胞表位的氨基酸-缬氨酸、亮氨酸及半胱氨酸所在的位置.综合以上分析结果获得所预测B细胞线性表位.以预测表位序列为参考,人工合成表位多肽,通过肽间接ELISA法验证所预测表位与IsdA多克隆抗体血清的免疫反应性. 结果 IsdA存在潜在的B细胞线性抗原表位,所预测表位区分别位于N末端P120-140、P181-200、P210-230和P300-320,间接ELISA检测rIs-dA多克隆抗体血清中存在着可与P210-230、P300-320结合的组分. 结论 IsdA蛋白潜在的B细胞线性表位位于N末端P210-230和P300-320区域,具有与特异性血清结合的能力,为金黄色葡萄球菌的表位疫苗研发奠定了基础.
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金黄色葡萄球菌isdA基因对宿主上皮细胞免疫指标的影响
目的 对金黄色葡萄球菌IsdA的编码基因缺失前后与宿主上皮细胞共孵育后的免疫学进行研究,为进一步研究金葡菌感染机制及抗金葡菌制剂的研究提供依据.方法 金黄葡萄球菌野生株Newman和IsdA缺失株Newman△IsdA分别作用于上皮细胞Hacat,运用实时荧光定量PCR、ELISA及Western Blot方法检测细胞促炎性细胞因子和趋化因子的分泌情况.结果 PCR结果表明,金黄色葡萄球菌IsdA+/均能提高上皮细胞分泌促炎性细胞因子(IL-8、TNF-α和IL-6),趋化因子MCP-1,表面受体TLR2和TLR4,C型植物血凝素-1(dectin-1)及抗菌肽LL-37的表达,而IsdA-/-诱导上皮细胞释放细胞因子的能力要低于IsdA+/+,但IsdA/-组上皮细胞因子水平高于正常对照组;通过ELISA、Western Blot检测与PCR结果一致.结论 研究表明,受金黄色葡萄球菌缺失株Newman△IsdA作用的上皮细胞促炎症因子分泌减少,细胞表面受体蛋白的表达和转录水平也相应降低,暗示了该缺失株的侵袭力降低,为进一步研究金葡菌感染机制及抗金葡菌制剂提供依据.
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金黄色葡萄球菌IsdA的B细胞免疫显性表位的鉴定及免疫保护效果的评价
目的 系统筛选鉴定金黄色葡萄球菌IsdA的B细胞免疫显性表位,并评价其免疫保护效果.方法 采用氨基酸步移策略,合成18 mer氨基酸重叠肽段.ELISA系统筛选鉴定IsdA的B细胞免疫显性表位肽段.免疫显性表位肽与KLH偶联后免疫Balb/c小鼠.分离免疫小鼠血清,ELISA检测免疫显性表位肽诱导的IgG抗体水平,并测定表位肽诱导产生抗体所介导的调理吞噬作用.末次免疫后2周,经尾静脉感染S.aureus Newman,监测感染攻毒后各组的小鼠的生存率以及检测主要靶器官肾脏的细菌定植量.结果 IsdA49-66aa、IsdA91-108aa、IsdA217-234aa、IsdA259-276aa均能与IsdA抗血清产生强烈IgG抗体反应.抗IsdA49-66aa、抗IsdA91-108aa抗IsdA217-234aa和抗IsdA259-276aa血清均能与重组的IsdA产生较强的抗原抗体反应.与Alum组相比,免疫IsdA49-66aa、IsdA91-108aa、IsdA217-234aa、IsdAzg-276aa后血清中的抗体能够显著增强抗体介导的中性粒细胞的调理吞噬作用(P＜0.05),同时均显著提高了小鼠的生存率,并在感染后的第3天均显著降低肾脏的细菌定植(P＜0.05).结论 成功鉴定出IsdA49-66aa、IsdA91-108aa、IsdA217-234aa、IsdA259-276aa为IsdA的B细胞免疫显性表位,显性表位肽IsdA49-66aa、IsdA91-108aa、IsdA217-234aa、IsdA259-276aa具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可以作为金葡菌疫苗研究的重要候选表位疫苗组分.
