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生存素反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的作用探讨
目的:探讨特异性生存素(survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对急性早幼粒细胞系HL-60细胞增殖、凋亡的影响.方法:人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染HL-60细胞后,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学变化,原位末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡指数(AI),RT-PCR半定量测定细胞中survivin mRNA的表达.结果:(1)survivin ASODN各浓度组对HL-60细胞的增殖均有抑制作用,且呈时间-剂量依赖性.(2)survivin ASODN处理组HL-60细胞的凋亡率与空白对照组、正义对照组和空转染组相比,差异有显著性(P＜0.01).(3)survivin ASODN处理组HL-60细胞的survivin mRNA表达水平明显下调.结论:survivin ASODN能明显抑制HL-60细胞中survivin mRNA的表达,诱导细胞凋亡.
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不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨
目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础.方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率.结果:脂质体转染效率低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率高,可达80%以上.结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值.
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Rab7在乳腺癌细胞中的表达及对信号EGFR的影响
目的:Rab7在两种乳腺癌细胞中的表达以及其对EGFR信号的影响.方法:培养乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB231,运用Western blot法检测Rab7在乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB231中的表达.通过脂质体转染法转染乳腺癌细胞MCF-7,筛选稳定表达质粒,运用Real-time PCR法检测siRNA对Rab7的干扰效果.MTT实验检测干扰Rab7后对乳腺癌MCF-7细胞生长情况的影响.Western blot法检测干扰Rab7后对MCF-7细胞中EGFR表达量的影响.结果:(1)Western blot检测结果示,Rab7在乳腺癌MCF-7与MDA-MB231细胞中均有表达,且在MCF-7细胞中高表达,与MDA-MB231细胞相比较,有统计学意义(P<0.05).(2)Real-time PCR检测结果示,siRNA能够有效干扰Rab7的表达.(3)MTT实验结果示,与无干扰试剂的non-silencing组相比,Rab7-siRNA细胞组的增值能力增强.(4)Western blot结果表明,与无干扰组相比比较,干扰组中的EGFR表达量明显增多,且在25、60min时,有统计学意义(P<0.05).结论:(1)Rab7在乳癌细胞MCF-7与MDA-MB231中均有表达,且在MCF-7细胞中高表达.(2)瞬时转染的干扰因子成功地沉默了Rab7,且沉默后的Rab7基因促进了细胞MCF-7的生长,促使EGFR的蛋白表达量增加.
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磷酸钙法与脂质体法转染HBV全基因组的比较
目的 比较磷酸钙法和脂质体法转染全长HBV基因组的效率及对HBsAg和HBeAg表达的影响.采用真核细胞报告基因SEAP与HBV DNA共转染人肝癌细胞系HepG2.方法 分别将带有分泌性碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的质粒、表达绿色荧光蛋白的PCI-EFGP质粒与HBV DNA共转染HepG2细胞.培养后48h计数表达绿色荧光蛋白的细胞,收取细胞培养上清,用ELISA法测定SEAP活性,IMX法检测HBV表面抗原和e抗原水平.结果 脂质体法转染HBV全基因组的效率明显高于磷酸钙转染法,转染后48h的细胞上清表面抗原和e抗原的袁达也明显高于后者.结论 脂质体转染法转染HBV的效率较磷酸钙转染法高,抗原表达水平高,是体外研究HBV的较理想方法.
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表达重组干扰质粒对Tca8113细胞c-erbB-2、Bcl-2基因表达干扰作用的实验研究
目的:探讨表达重组干扰质粒(RNAi技术)对人舌鳞癌细胞株(Tca8113)细胞中c-erbB-2、Bcl-2基因表达的干扰效率.方法:按siRNA设计原则设计针对c-erbB-2、Bcl-2基因的Oligo DNA,体外化学合成Oligo DNA,Oligo DNA退火、连接、转化、筛选克隆,构建针对c-erbB-2基因的表达重组RNA干扰质粒(psiC1、psiC2、psiC3)和针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒(psiB1、psiB2、psiB3),细胞脂质体转染Tca8113细胞,Real-time RT-PCR的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线的数据收集处理,采用荧光定量RT-PCR方法检测重组干扰质粒对Tca8113细胞中c-erbB-2、Bcl-2基因表达的干扰效率.结果:实时荧光定量RT-PCR方法检测psiC1、siC2、psiC3质粒脂质体转染后c-erbB-2基因的表达情况结果显示psiC2、psiC3相对于对照组均有不同程度的干扰效果,psiC1相对于对照没有干扰效果.psiC2的干扰程度较大为62.68%,psiC3的干扰程度较小为40.61%.psiB1、psiB3相对于对照组无明显干扰效果,psiB2的干扰程度高达66.20%.结论:针对c-erbB-2、Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒psiC2(gAgTCCCAACCATgTCAAA)、psiB2(CCgggAgATAgTgATgAA)能有效沉默Tca8113细胞中c-erbB-2、Bcl-2基因的表达.
关键词： 重组干扰质粒 脂质体转染 基因表达 实时荧光定量RT-PCR -
脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较
目的：对比脂质体与电穿孔法对 HepG2、SGC7901/ADM 两种细胞的转染效率。方法以 HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象，采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3．1‐EGFP质粒，流式细胞仪计算细胞存活率，借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为（20．8±2．1）％，而电穿孔法转染效率增高至（49．6±2．5）％，二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为（25．4±1．3）％，而电穿孔法转染效率增高至（52．6±2．1）％，二者比较差异亦有统计学意义（P＜0．05）。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。
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可视化人鼻咽癌细胞模型5-8F-EGFP的建立
目的:利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料.方法:利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP.结果:成功获得稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞5-8F-EGFP细胞株,比较5-8F和5-8F-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等都没有显著性差异.结论:我们建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实基础.
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人TCPllL2和鼠Tcp1112基因的定位及表达的初步研究
目的 观察人TCP11L2和鼠Tcp1112基因在细胞中的表达及定位和Tcp1112基因的表达谱研究.方法 用RT-PCR法从正常人和鼠睾丸组织中分别扩增得到人TCP11L2基因和鼠Tcp1112基因的开放读码框全长cDNA并定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中,构建了pEGFP-TCP11L2和pECFP-TcP1112融合基因表达载体,然后以脂质体介导转入MDCK细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的表达情况;RT-PCR检测鼠Tcp1112基因在组织中的表达情况.结果 在转染重组真核表达栽体pEGFP-TCPllL2、pECFP-Tcp1112的MDCK细胞中,荧光主要集中在细胞核外区域,而在转染空白载体pECFP-N1的细胞中,荧光布满整个细胞;RT-PCR检测鼠Tcp1112为多组织表达.结论 人TCP11L2和鼠Tcp1112蛋白能在MDCK细胞中高效表达,表达的蛋白定位在细胞核外区域,鼠Tcp1112的多组织表达提示该基因与鼠Tcp11基因功能的不同.
关键词： 人TCP11L2基因 鼠Tp1112基因 脂质体转染 亚细胞定位 -
HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装
目的 构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3'UTR RNA 与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础.方法 根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达.结果 经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体.通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光.嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达.结论 成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株.
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阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究
目的 优化阳离子脂质体介导肽核酸(PNA)转染K562细胞的条件.方法 以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将标记有FITC荧光基团的PNA转染K562细胞,在荧光显微镜下观察并计算其转染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)检测其细胞毒性.应用正交试验筛选出佳的PNA和脂质体的用量及比例,并优化稀释用培养基血清浓度,以获得优的转染效果.结果 以2.5× 105/mL～3×105/mL的细胞密度接种,100 μL/孔的培养基中加入PNA 6.25 pmol,PNA与脂质体的体积比为1∶3.5,稀释用培养基未加胎牛血清时,细胞转染效率和细胞毒性佳,转染效率为87.2％,细胞存活率(RGR)为94.1％.结论 PNA可通过阳离子脂质体转染进入K562细胞,优化条件后得到的细胞转染效率和细胞存活率能够满足基因表达研究的实验要求.
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SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达
目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体,建立稳定表达SOX9的LNCaP细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因,将其克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro中,双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞,经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.qRT- PCR和Western Blot分别检测SOX9 mRNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCaP细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株,qRT- PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体pLVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功,实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.
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WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达
目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体,建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法 PCR扩增WDR5基因,将WDR5插入pCI-neo载体中,酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞,Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的mRNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后,用G418筛选获得稳定表达的细胞株,Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达,为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.
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Glypican-3的真核表达及单克隆抗体的制备
目的: 建立能够稳定表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3, GPC3)的细胞株, 制备抗人GPC3的单克隆抗体(mAb).方法: 利用脂质体技术将GPC3重组质粒导入NIH3T3细胞, RT-PCR检测; 以原核表达的GPC3片段为免疫原, 经传统的杂交瘤技术获得稳定分泌抗免疫原的mAb细胞株, Western blot和免疫荧光技术鉴定mAb特性.结果: 成功获得一株稳定表达GPC3的细胞株, 即NIH3T3-GPC3; 建立5株能稳定分泌抗原核表达GPC3片段抗原的mAb细胞株.mAb细胞株的免疫球蛋白亚类是IgG2a.间接ELISA、Western blot和免疫荧光实验的结果证明, 仅杂交瘤GPC34H11能分泌与完整的人GPC3蛋白结合的mAb.结论: 建立稳定表达GPC3的鼠源模型细胞株; 获得识别天然GPC3分子的mAb细胞株.
关键词： glypican-3 脂质体转染 单克隆抗体 杂交瘤 -
HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达
目的:克隆人抗原R基因(HuR)的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株.方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达.结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功.Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作.
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鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达
目的构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体，转染人胃癌细胞株SCG7901，检测蛋白表达. 方法采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin，酶切鉴定和测序；采用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901，G418抗性筛选；Western blot检测血管抑素的表达. 结果酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素真核表达载体，经G418筛选和Western blot检测得到高表达血管抑素的细胞株. 结论真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin转导的人胃癌细胞能够表达血管抑素蛋白，在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值.
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人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞系中的瞬时表达研究
目的研究人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3中的瞬时表达情况.方法采用脂质体转染法将携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子-人胰岛素原基因的质粒转染到体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3 中,转染后48h,用放射免疫分析方法(RIA)分别测定NIH3T3细胞内外的胰岛素水平.结果 NIH3T3细胞外的胰岛素水平于转染前后无显著性变化(P>0.05),而细胞内的胰岛素水平则于转染后明显升高(P<0.05).结论转染后48h的人胰岛素原基因在NIH3T3细胞内有较高的胰岛素表达水平,使Ⅰ型糖尿病的基因治疗成为可能.
