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重组人生长激素基因细胞移植
目的通过重组人生长激素基因细胞移植为生长激素缺乏病(GHD) 基因治疗的生物学表达研究奠定基础.方法构建pLXSNhGH人生长激素(hGH)逆转录病毒表达载体后 ,脂质体转染包装细胞系PA317,提取包装细胞上清的病毒后,将病毒感染原代小鼠胚胎成纤维细胞,将细胞移植于小鼠腹腔内,观察hGH的表达情况.结果 hGH体内持续表达达2个月以上,但由于高滴度抗hGH抗体的影响,表达水平呈波动性.结论重组人生长激素基因原代成纤维细胞移植体内的持续表达, 为细胞移植系统引入GHD基因治疗的研究奠定了实验基础.
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稳定表达TRPA1通道的HEK-293 T细胞模型的建立
目的 建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功.方法 构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达.结果 经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因.结论 成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础.
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hFcεRIα/RBL-2 H3细胞株的构建与评价
目的：构建稳定表达人 FcεRIα( hFcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用 RT-PCR技术克隆 hFcεRIα基因,构建真核表达载体 pCI-neo-hFcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75．38%。经 Western blot、免疫荧光及 RT-PCR 鉴定, hFcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建hFcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究IgE与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。
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TGF-β1、bFGF双基因修饰骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 以脂质体为载体来介导转化生长因子-β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察两基因的表达情况.方法 对 SD大鼠的 BMSCs采用贴壁法联合 Percoll密度梯度离心法获得.使用PCR技术获得TGF-β1基因、bFGF基因,将其基因在真核表达载体 pcDNA3.1(+)上构建,再将两种真核表达载体通过脂质体转染至第3代 BMSCs.采用 RT-PCR、Western blot检测 BMSCs中 bFGF、TGF-β1基因的表达水平.结果 贴壁法联合Percoll密度梯度离心可以获得 BMSCs.成功构建 pcDNA3.1(+)-bFGF和 pcDNA3.1(+)-TGF-β1真核表达载体后,将其转染 BMSCs,RT-PCR、Western blot均可检测到 bFGF、TGF-β1基因的表达.结论 bFGF和TGF-β1可以通过脂质体转染方式修饰BMSCs,并获得高效表达.
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大鼠L6骨骼肌成肌细胞脂质体转染条件的研究
目的探讨脂质体介导基因转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的适转染条件,同时观察绿色荧光蛋白作为报告基因用于脂质体转染条件优化的可行性.方法以绿色荧光蛋白为报告基因,通过改变质粒DNA、脂质体与质粒的比例及转染时间,在荧光显微镜下观察并计算转染效率.结果在20 mm培养皿中,1μDNA与1μl脂质体转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞6 h,转染效率高.结论建立了脂质体转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的优化转染方法;绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件.
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TET1过表达载体构建及其稳定过表达的宫颈癌HeLa细胞鉴定
目的 构建甲基胞嘧啶双加氧酶1(TET1)过表达载体并对其稳定过表达的宫颈癌HeLa细胞进行鉴定.方法 从人宫颈癌组织中扩增出 TET1目的片段并将其克隆到 pLVX-MYRF 载体上,构建真核表达载体pLVX-MYRF-TET1,进行双酶切及测序验证.选择宫颈癌HeLa细胞,随机分为TET1组、阴性对照组,采用脂质体转染法分别转染重组质粒pLVX-MYRF-TET1、空质粒pLVX-MYRF,采用Real-time PCR法和Western blotting法检测两组TET1 mRNA和蛋白表达.结果 经双酶切分析及测序验证,成功构建了真核表达载体pLVX-MYRF-TET1.与阴性对照组比较,TET1组TET1 mRNA和蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05).结论 成功构建TET1过表达载体pLVX-MYRF-TET1,并且能在宫颈癌HeLa细胞中稳定过表达.
关键词： 宫颈癌 Hela细胞 甲基胞嘧啶双加氧酶1 载体构建 脂质体转染 -
肌肉生长抑素基因过表达对3T3-L1细胞增殖的影响
目的 观察小鼠肌肉生长抑素(mMSTN)对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响.方法 小鼠肌肉组织mMSTN基因表达序列,构建pcDNA3.1(+)-mMSTN真核表达质粒.采用阳离子脂质体转染法,观察mMSTN过表达对细胞增殖的影响.结果 DNA测序鉴定证实成功构建mMSTN真核表达质粒.质粒转染后,mMSTN mRNA和蛋白表达显著增高,分别达到对照组的7.63倍和1.38倍(P值均＜0.05),而且能明显促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖,是对照组的1.67倍(P ＜0.001).结论 成功构建mMSTN真核表达载体,该载体过表达显著促进3T3-L1细胞的增殖.
关键词： 肌肉生长抑素(MSTN) 质粒构建 3T3-L1前脂肪细胞 脂质体转染 细胞增殖 -
HBx基因瞬时转染对 SUDHL-4细胞增殖的影响
目的：研究HBx基因瞬时转染对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法：用分子克隆方法构建HBx基因的真核载体pcDNA3．1-X，利用脂质体转染法将pcDNA3．1-X转入淋巴瘤细胞SUDHL-4中，构建整合有HBx基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作为对照，利用CCK8法检测细胞转染24、48、72和96 h后的增殖活性，绘制生长曲线；应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。结果：重组质粒双酶切结果及测序结果表明成功构建pcDNA3．1-X，转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA及蛋白的表达。与SUDHL-4组及SUDHL-4-con组相比，SUDHL-4-HBx组细胞的增殖能力下降，G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，凋亡率升高（P＜0．05）。结论：瞬时转染HBx基因后，SUDHL-4细胞增殖减缓，细胞周期阻滞于G0／G1期，凋亡率增加。
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电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响
目的 通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索佳的细胞转染方法和条件.方法 以K562、HepG2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒pCDNA3.1、pCDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达.结果 当脉冲20 ms、电阻90 Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90 Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,HepG2细胞可以得到较高的转染效率.在K562细胞和HepG2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P＜0.05).电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和HepG2细胞的存活率显著低于脂质体法(P＜0.05).Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P＜0.05).结论 佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳.
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AFP的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响
目的 观察甲胎蛋白(AFP)在不同肿瘤细胞中的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响.方法 运用免疫荧光的方法观察内源性AFP在HeLa细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞中的亚细胞定位.将构建的表达AFP的质粒pcDNA3-AFP及AFP腺病毒siRNA干涉载体Adv-AFP siRNA作用于QGY-7703细胞,MCF-7细胞,运用MTT,集落形成实验检测细胞增殖状况.结果 免疫荧光显示,内源性的AFP在 HeLa细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞均只在细胞质中表达.pcDNA3-AFP 使QGY-7703的细胞活性增加了21%(P＜0.05)及集落形成能力增加了32 %(P＜0.01),MCF-7实验组比对照组细胞活性降低了30%(P＜0.01),克隆形成能力降低82 %(P＜0.01).Adv-AFPsiRNA使QGY-7703的细胞活性降低了22 %(P＜0.05),平均克隆形成能力降低52 %(P＜0.01),MCF-7细胞活性提高了24.5 %(P＜0.05),克隆形成能力提高了89 %(P＜0.01).结论 内源性的AFP只在细胞质中表达.AFP能促进QGY-7703细胞的增殖及克隆形成能力,而在MCF-7细胞中发挥相反的作用.腺病毒介导的内源性的AFP表达的下调能降低QGY-7703的增殖,却增加了MCF-7的细胞活性及克隆形成能力.
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XIAP反义寡核苷酸对肾癌细胞的作用及对其化疗敏感性的影响
X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)是新近发现的强有力的凋亡抑制因子,在人类肿瘤中过度表达,这使其成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点[1].我们合成靶向XIAP的反义寡核苷酸(ASODN),将其转染肾癌细胞株786-0,观察其对786-0细胞增殖和凋亡的影响及对化疗药物的作用.一、材料与方法1.材料:兔抗人XIAP单克隆抗体(Serotec公司);Lipofectin 2000脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司);逆转录聚合酶链反应试剂(RT-PCR)(Promega公司);SDS、PVDF膜(Sigma公司);顺铂(山东罗欣药业公司).
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体外脂质体转染兔成肌细胞优化条件的研究
成肌细胞是哺乳动物体内唯一能大量分裂、增殖和迁移的肌前体细胞[1].血管内皮生长因子(VEGF)具有促进血管内皮细胞增殖、促进血管生长的作用[2].我们以脂质体介导VEGF165基因转染成肌细胞,研究转染的佳实验条件.
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表达胶质细胞源性神经生长因子的骨髓基质干细胞的神经分化潜能
有研究表明,骨髓基质干细胞(BM-SC)可以向神经细胞分化,且易于获取[1],因此被认为是治疗中枢神经系统疾病理想的细胞载体.我们以胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)为目的基因,采用阳离子脂质体转染方法,对BMSC的基因工程化和神经分化潜能进行了初步研究.
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载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 T→A突变对其转录的影响
为探讨载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 bp处的碱基突变(T→A)对载脂蛋白CⅡ基因转录的影响,及其与血浆载脂蛋白CⅡ浓度降低的关系.通过定点诱变技术构建带有-190 bp处 T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达载体pGL3;应用脂质体介导的基因转染技术,将带有正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达质粒和构建的突变质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染HepG2细胞,瞬时表达;利用双荧光素酶测试系统检测荧光素酶活性.结果发现,带有启动子区-190 T→A突变的载脂蛋白C Ⅱ启动子的荧光素酶表达活性比正常的载脂蛋白C Ⅱ启动子的表达活性低18.56%.结果提示,载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 bp处的碱基由T突变为A降低了载脂蛋白CⅡ启动子的转录活性.
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可视化人鼻咽癌细胞模型6-10B-EGFP的建立
目的 利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的实验材料. 方法 利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP. 结果 成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌6-10B-EGFP细胞株,比较6-10B和6-10B-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等差异都没有显著性. 结论 成功建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株6-10B-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实基础.
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人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立
目的 建立人乳头状瘤病毒(HPV)16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系.确证HPV与喉癌的发生有无关系.方法 采用脂质体介导法,将pSV HPV16 DNA导入原代培养的人喉上皮细胞,继续培养、传代,取20代细胞.用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段,用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表迭,用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性.结果 有3株细胞已连续培养传代超过20代,细胞含有HPV16 DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达,细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长.生长曲线呈典型的"S"型,细胞增殖指数为48％,所有细胞均表达角蛋白,胞浆含张力原纤维,软琼脂培养克隆形成试验阴性.结论 成功建立了HPV16 DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系,为喉癌研究提供了新的理想模型,HPV16对人喉上皮有致癌作用,在喉癌组织标本中检测到的HPV16 DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 人喉上皮 永生化 脂质体转染 细胞培养 -
可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立
目的 利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料.方法 利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP.结果 成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异.结论 建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础.
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用B7+瘤细胞诱导抗肿瘤CTL及其杀伤活性的测定
目的和方法:研究利用脂质体转染的方法,将小鼠B7基因导入C57BL小鼠大肠癌细胞株CMT93细胞(弱免疫原性).用800 μg/mL的G418筛选得到阳性克隆,免疫组织化学检测发现B7分子得到充分表达,主要以细胞膜染色为主,也有部分细胞浆着色.
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人β-NGF及BDNF基因共转染对大鼠骨髓基质细胞分化的影响
目的 探讨人β-神经生长因子(β-NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)基因共转染对大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化的影响. 方法 梯度离心法分离培养大鼠胫股骨骨髓中BMSCs,用Src癌基因同源区3抗体(SH3)的免疫细胞化学染色鉴定BMSCs.按照3μL脂质体/1μg(3 μL)pSVCEP NGF/BDNF-CAT质粒的比例共转染第一代BMSCs,并转染pEGFP-C1质粒作为转染的标记.BMSCs培养4周后,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达并计算转染率,细胞免疫荧光染色后用激光扫描共聚焦显微镜观察表达产物以及BMSCs分化情况. 结果 体外培养能够获得纯化的原代和传代BMSCs,传代后仍然保持增殖和分化功能;免疫组化SH3染色阳性证实为纯化的BMSCs.人β-NGF/BDNF基因共转染BMSCs后,BMSCs能够稳定和持续表达NGF和BDNF;BMSCs也能表达Nestin、NSE、NF-M和GFAP. 结论 经脂质体介导的外源性目的 基因NGF/BDNF cDNA均能分别和共同在BMSCs中成功表达,基因转染后的BMSCs能诱导分化为神经前体细胞或神经样细胞.
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以GFP为报告基因优化CNE-2Z细胞脂质体转染条件的实验研究
目的:为在脂质体介导基因转染人低分化鼻咽癌上皮细胞株CNE-2Z时获得较高转染效率,同时观察GFP作为报告基因用于脂质体转染条件优化的可行性。方法:以GFP为报告基因,通过比较碱裂解法与PEG纯化法制备质粒;改变DNA、脂质体量及转染时间,在荧光显微镜下观察并计算转染效率。结果:在35 mm培养皿中,2 μ gDNA与4 μ L脂质体转染CNE-2Z细胞8 h,转染效率高,且在显微镜下观察不到细胞的形态变化。结论:在35 mm培养皿中,2 μ gDNA与4 μ L脂质体转染CNE-2Z细胞8 h,可获得佳转染效率,GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件
