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通过CRISPR/Cas9系统敲除人源PDE10A基因
目的 建立敲除基因组中PDE10A基因的CRISPR/Cas9系统.方法 设计3个长20bp的sgRNA,分别靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11.化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆进PX330质粒中.将克隆正确的质粒PX330-sgRNA转染至HEK293T细胞中,提取基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,再通过SURVEYOR分析和一代测序对敲除效率进行检测.后采用有限稀释法挑选稳定敲除PDE10A的HEK 293T细胞株.结果 目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入PX330质粒中且序列正确;靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A,且敲除效率高达31.4％;稳定敲除PDE10A的细胞株筛选成功,可导致2 bp缺失.结论 PDE10A基因CRISPR/Cas9敲除系统构建成功.
关键词： PDE10A CRISPR/Cas9 稳定细胞株 -
重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义
本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义.将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上；利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体；将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N.结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功；通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功.结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等.
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抑制Rab25基因表达的人NSCLC厄洛替尼耐药细胞PC9/ER的建立
目的 Rab25在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)等多种肿瘤中过度表达,提示其可能在NSCLC的发生发展及耐药形成中发挥重要作用.为进一步探讨Rab25的功能及其在NSCLC酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐药形成中的作用,建立稳定慢病毒介导的shRNA靶向干扰Rab25基因人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞PC9/ER稳定株.方法 实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测PC9/ER及PC9细胞中Rab25基因mRNA的相对表达情况.筛选出Rab25基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA并构建GV248 shRNA-Rab25慢病毒载体,酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染PC9/ER细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株.RT-PCR鉴定PC9/ER的表达,CCK-8检测对厄洛替尼的敏感性.结果 PC9/ER细胞中Rab25基因的mRNA表达水平显著高于PC9细胞.构建的重组慢病毒质粒经测序鉴定正确.RT-PCR证实,干扰Rab25后,PC9/ER细胞株中Rab25表达水平明显降低,抑制率为88.3％.通过传代10次后,PC9ER-Rab25i稳定细胞株中Rab25基因的mRNA表达水平显著低于阴性对照组,P＜0.05.PC9ER-Rab25i稳定细胞株的IC50为(2.133±0.222) μmol/L,显著低于阴性对照组的(6.375±0.799) μmol/L,P=0.007.结论 成功构建了Rab25-shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制Rab25基因表达的人NSCLC厄洛替尼耐药细胞PC9/ER,初步验证Rab25基因能够改善肺癌EGFR-TKIs获得性耐药,为进一步研究Rab25在NSCLCEGFR-TKIs获得性耐药的机制及逆转其获得性耐药提供了可靠的细胞模型.
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稳定表达RFX6基因肝癌细胞株的建立
目的:建立稳定表达RFX6基因的肝癌细胞株.方法:构建人源RFX6基因的重组质粒(pLNCX2-RFX6),pVSV-G质粒分别与pLNCX2-RFX6和空载体pLNCX2共转染至GP2-293细胞中进行包装,并用包装的逆转录病毒感染人肝癌QGY-7703细胞株,G418筛选出阳性克隆.RT-PCR和蛋白质印迹法验证稳定细胞株RFX6基因表达情况.采用Image J软件进行灰度值分析比较两株细胞系的差异.结果:在QGY-7703-pLNCX2-RFX6和QGY-7703-pLNCX2细胞中,RFX6/18S mRNA电泳条带灰度比值分别为5.044 0±1.384 0和0.357 2±0.407 9,QGY-7703-pLNCX2-RFX6细胞RFX6/18S是QGY-7703-pLNCX2细胞的14.1倍,差异有统计学意义,t=4.143,P＜0.05;而在两细胞株中,RFX6/GAPDH的蛋白质印迹条带灰度值分别为1.391 4±0.141 3和0.127 8±0.037 3,QGY-7703-pLNCX2-RFX6细胞RFX6/GAPDH是QGY-7703-pLNCX2细胞的10.9倍,差异有统计学意义,t=14.966,P＜0.05.结论:成功构建稳定表达RFX6基因的肝癌细胞株,为研究RFX6基因在肝癌细胞中的功能奠定了基础.
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慢病毒介导的稳定表达人睾丸组织泛素连接酶TRIM69基因的细胞系的建立
目的 利用改造的慢病毒表达系统构建表达人睾丸组织新的泛素连接酶TRIM69基因的稳定细胞系.方法 采用RT-PCR方法从人胚肾细胞系HEK293T cDNA中扩增TRIM69基因及其缺失RING结构域的突变体,将其克隆至改造的plentilox3.7慢病毒载体中.将慢病毒质粒pLenti-TRIM69或其突变体与慢病毒辅助质粒(plpl,plp2,VSVG)共转染HEK293T 包装细胞,产生有活性的病毒.包装后的重组慢病毒感染HEK293细胞,Western blot检测确认TRIM69及其突变体蛋白的表达.结果 经Western blot检测证实,成功建立了稳定表达TRIM69基因及其突变体的293细胞系.结论 利用慢病毒成功制备稳定表达TRIM69基因及其突变体的293细胞系,这些细胞为TRIM69生物学功能的研究提供了平台.
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稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定
目的 构建稳定表达人血红素加氧酶-1 (HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用.方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒.用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Western blot检测H0-1的表达.将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plp1、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞,包装有活力的慢病毒.用携带H0-1的慢病毒感染HEK293T细胞,筛选出能稳定表达目的基因的单克隆,并行Western blot检测H0-1的表达.将过氧化氢加入正常的及过表达H0-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞,检测细胞内活性氧的含量.结果 成功筛选出能稳定表达H0-1的单克隆细胞系并扩大培养,Western blot检测其H0-1的表达明显升高.加入过氧化氢后,过表达H0-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少.结论 成功构建了能稳定表达人H0-1的细胞系,内源性过表达H0-1能够对抗细胞的氧化损伤.
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白细胞介素18受体α与β真核表达载体构建及白细胞介素18受体β稳定表达细胞株的建立
目的:构建人白细胞介素18受体IL-18Rα,β真核表达载体pcDNA3.1-zeocin/IL-18R α pcDNA3.0/IL-18R β,并将pcDNA3.0/IL-18R β稳定转染293细胞,构建IL-18R β稳定表达细胞株,用于建立IL-18信号转导的体外细胞模型.方法:实验于2006-06/2007-05在北京大学医学部免疫系实验室完成.扩增并克隆人IL-18R α和IL-18R β cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1-zeocin/IL-18R α,pcDNA3.0/IL-18R β.将pcDNA3.0/IL-18R β转染293细胞,经G418筛选建立起稳定表达IL-18R β的细胞株,Western-blot方法检测稳定细胞株IL-18R β的表达,挑选表达较高的细胞转染IL-18Rv,通过NF-к B依赖的Luciferase检测IL-18信号转导通路的建立.结果:成功构建了IL-18R α和IL-18Rβ的真核表达载体,ID-18Rβ的基因稳定转染到了293细胞中并获得了表达,通过瞬时转染IL-18Rα真核表达载体,在293细胞中建立了IL-18信号转导的体外细胞模型.结论:成功建立起了IL-18诱导NF-к B活化的体外细胞模型,为进一步研究IL-18信号转导途径奠定了基础.
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稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立
目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株.方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性.结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P＜0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P.＜0.05).结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段.
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慢病毒介导的shRNA靶向干扰I2PP2A胃癌稳定细胞株的建立
背景与目的：蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A，I2PP2A)在包括胃癌的多种肿瘤中过度表达，提示其可能在胃癌的发生中发挥重要作用。为进一步探讨I2PP2A的功能及其在胃癌发生中的作用，建立稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株。方法：筛选出I2PP2A基因的RNA干扰(RNA interference，RNAi)有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA并构建pGLV2_shRNA_I2PP2A慢病毒载体，酶切和测序鉴定正确后，经病毒包装，感染BGC823细胞，经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株，通过实时定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定I2PP2A的表达。结果：重组慢病毒质粒经测序鉴定正确；RT-PCR和Western blot证实干扰I2PP2A后，BGC823细胞株中I2PP2A表达水平明显降低，抑制率约为90%。结论：成功构建了I2PP2A shRNA慢病毒表达载体，建立了稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株，为进一步研究I2PP2A在胃癌发生中的作用提供了可靠的细胞模型。
关键词： 蛋白磷酸酶2A抑制剂-2 胃癌 慢病毒 稳定细胞株 -
Tet-off诱导表达Egr-1 HEK293稳定细胞株的建立和鉴定
目的:利用大肠埃希菌Tet-off诱导表达调控系统构建多西环素调控的稳定细胞株.方法:以pEGFPEgr-1质粒为模板,扩增含早期生长反应蛋白(early growth response-1,Egr-1)完整开放阅读框的DNA序列,经酶切后插入含四环素反应元件(tetracycline responsive element,TRE)序列的表达载体pTRE2hyg,获得重组质粒pTRE2hyg-Egr-1,将其转染293Tet-off细胞株,并用G418和多西环素筛选稳定表达Egr-1的细胞株.蛋白质印迹法检测多西环素诱导表达Egr-1情况;流式细胞术检测细胞增殖能力.结果:蛋白质印迹结果显示,外源性Egr-1蛋白表达受细胞培养液中多西环素调控,当从细胞培养液中去除多西环素后,Egr-1表达量明显升高.流式细胞检测结果显示Egr-1高表达细胞的增殖能力明显高于Egr-1低表达细胞.结论:利用Tet-off体系成功构建Egr-1诱导表达的细胞株,细胞的增殖能力受Egr-1表达水平的影响.
关键词： Tet-off调控系统 早期生长反应蛋白1 稳定细胞株 多西环素 -
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶稳定敲低对肾透明细胞癌细胞迁移的抑制作用
目的 肾透明细胞癌(ccRCC)是一种代谢性疾病,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与ccRCC的发生发展及患者的不良预后呈正相关.文章首次构建了G6PD缺陷型ccRCC稳定细胞株,检测其迁移表型.方法 OligoEngine RNAi设计针对人G6PD基因3′端非编码区的siRNA及无关siRNA序列,合成双链后通过BglⅡ和HindⅢ酶切位点插入pSP-GFP/Neo表达载体,构建Caki-1-G6PD siRNA细胞株及Caki-1-Negative control细胞株,进而转染并经G418筛选.应用Real-time RT-PCR、Western blot及酶活性方法,检测细胞株的G6PD表达和酶活性;Transwell方法检测细胞迁移表型、Western blot检测p-STAT3/STAT3表达.结果 荧光显微镜下可见Caki-1-G6PD siRNA细胞与Caki-1-Negative control细胞形态良好,通过GFP表达量计算细胞转染效率约为45％～55％;48 h后细胞贴壁密度达90％,荧光表达略有增强,转染效率可达60％.光镜和荧光显微镜下亦可见细胞状态良好,GFP阳性率达95％.与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA细胞的G6PD mRNA表达量蛋白表达量和酶活性均显著降低(P<0.05).与Caki-1-Negative control细胞相比,Caki-1-G6PD siRNA迁移细胞的相对数量明显降低[(64.0±4.2)个vs(30.0±2.9)个,P<0.01],p-STAT3/STAT3值亦明显下降[(0.45±0.05)vs(0.24±0.01),P<0.01].结论 文章首次成功构建了G6PD稳定敲低和迁移能力低下的Caki-1细胞系,其G6PD敲低所致ccRCC细胞迁移能力降低与STAT3信号相关.
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慢病毒介导的干扰ClC-3肝癌稳定细胞株的建立及其侵袭和迁移能力的改变
目的建立慢病毒介导的靶向干扰电压门控氯通道3(voltage-gated chloride channel 3,ClC-3)的稳定肝癌细胞株,并探讨其侵袭和迁移能力的改变。方法构建靶向 ClC-3的3个短发夹状RNA ( short-hairpin RNA, shRNA)慢病毒表达载体,293FT细胞包装慢病毒并测定滴度。重组慢病毒感染肝癌细胞株MHCC97H,筛选稳定干扰细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测ClC-3 mRNA和蛋白的表达以确定干扰效率。 Transwell小室实验(含Matrigel和不含Ma-trigel)和细胞划痕实验检测ClC-3基因被抑制后侵袭和迁移能力的改变。结果成功获得4种慢病毒,感染MHCC97细胞后,建立1株阴性对照细胞和3株 ClC-3稳定干扰细胞( MHCC97H/shClC-3-1、shClC-3-2和 shClC-3-3)。3株稳定干扰细胞ClC-3 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照细胞(P<0．01),MHCC97H/shClC-3-2细胞对ClC-3的抑制效果好。与阴性对照细胞相比,MHCC97H/shClC-3-2细胞侵袭和迁移能力都下降( P<0．01)。结论成功建立稳定干扰ClC-3基因的肝癌细胞株,ClC-3表达抑制会降低MH-CC97H细胞的侵袭和迁移能力。
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hFcεRIα/RBL-2 H3细胞株的构建与评价
目的：构建稳定表达人 FcεRIα( hFcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用 RT-PCR技术克隆 hFcεRIα基因,构建真核表达载体 pCI-neo-hFcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75．38%。经 Western blot、免疫荧光及 RT-PCR 鉴定, hFcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建hFcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究IgE与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。
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CaMKⅡα/β稳定表达的PC12细胞株的构建及其功能的初步研究
目的 建立稳定表达CaMKⅡα/β的PC12稳定细胞株,以便进一步研究钙/钙调素依赖性蛋白激酶CaMKⅡα/β不同亚型的生理功能.方法 通过脂质体介导的方法将构建的表达载体pEGFP-CaMKⅡα/β转染入PC12细胞中,然后用含G418抗生素的选择性培养基进行长期筛选,挑取耐药单克隆,培养并收集耐药的单克隆细胞;通过MTT法检测转染细胞在体外对PC12细胞增殖与活性的影响;Western结果 MTT细胞活性检测结果显示,转染重组质粒pEGFP-N1-CaMKⅡα/β的PC12细胞稳定株的生长活性与对照组相接近.应用Western blot方法对融合蛋白CaMKⅡα/β-GFP在PC12细胞内的表达进行鉴定,结果 显示在PC12-CaMKⅡ α/β组中,分子量82/89 ku处检测到该目的基因的大量表达,而在对照组的相应位置则没有任何条带,表明外源性目的基因已在细胞内过表达.Western blot方法检测突触囊泡蛋白结果显示CaMKⅡα/β不同亚型的过表达对囊泡蛋白的影响并无差异.HPLC检测结果显示过表达的CaMKⅡα/β对PC12细胞中DA的释放差异具有显著性.结论 该实验获得稳定表达pEGFP- CaMKⅡ α/β的PC12细胞株.初步探讨了该激酶的不同亚型对细胞功能的影响.
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糖原合成酶激酶3β转基因细胞模型的建立
目的 建立GSK3β(糖原合成酶激酶3β)转基因细胞模型.方法 RT-PCR方法扩增GSK3β基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染PC12细胞;Western blot验证稳定株;染色质染色法和流式细胞术检测细胞凋亡;MTT法确定细胞接种条件.结果 成功获得GSK3β融合载体;并建立GSK3β转基因细胞株;转基因组中GSK3β蛋白表达量明显高于对照组,染色质明显浓染甚至出现凋亡小体,去血清后该变化更加明显;GSK3β转基因组早期凋亡的细胞含量比对照组明显增多;确立了转基因细胞筛选化合物的接种条件.结论 成功建立GSK3β转基因细胞模型.
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稳定表达NLRC5基因肝癌细胞株的建立
目的 建立起能够稳定表达 NLRC5 基因的肝癌HepG2细胞株. 方法 设计遗传霉素( G418 )的浓度梯度,通过对HepG2 细胞筛选终确定筛选药物浓度. 将构建好的人源pEGFP-C2-NLRC5重组质粒利用脂质体介导法转染至HepG2肝癌细胞株中,用G418筛选出耐药阳性克隆. 通过免疫荧光技术观察绿色荧光蛋白稳定表达情况, Western blot法验证NLRC5蛋白表达情况. 结果 G418 在14 d内使HepG2细胞全部死亡的小浓度是300 ng/ml. 用G418筛选瞬转pEGFP-C2-NLRC5 14 d在荧光显微镜下可见耐药克隆的形成. Western blot法检测显示,稳定过表达组 NL-RC5的蛋白水平比空质粒转染组高(t=15. 356,P<0. 05).结论 成功构建稳定表达NLRC5 基因的肝癌细胞株,为进一步研究NLRC5基因在肝癌的体内实验奠定了基础.
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高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建
目的：建立稳定高表达重组人组织激肽释放酶7基因（ KLK7）的前列腺癌细胞株DU145，为前列腺癌发生机制的研究奠定基础。方法 PCR法扩增KLK7 cDNA，并克隆到真核表达载体pcDNA3．1上；经过限制性内切酶酶切、DNA测序验证正确后，以脂质体法转染人前列腺癌DU145细胞；通过G418筛选，每个单克隆细胞扩大培养，建立稳定转染KLK7的DU145单克隆细胞株。采用Western blot 法检测DU145细胞株KLK7表达。结果酶切鉴定及DNA 测序分析显示 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体成功构建；转染后，成功获得稳定高表达KLK7的DU145单克隆细胞株。 Western blot 结果显示，pcDNA3．1-KLK7转染的DU145细胞KLK7表达量明显高于转染空载体组细胞（P＜0．01）。结论 pcDNA3．1-KLK7真核表达载体的建立及稳定高表达KLK7的前列腺癌单克隆细胞株的建立，为研究KLK7在前列腺癌发生发展中的作用提供了条件。
关键词： 重组人组织激肽释放酶基因7 前列腺癌 稳定细胞株 真核表达载体 -
小动物活体成像生物发光稳定细胞株的构建
目的 构建能用于小动物活体成像系统的、能稳定表达荧光素酶基因的小鼠Panc02胰腺癌细胞株制作动物模型.方法 利用表达荧光素酶基因pGL4.20为载体,转染小鼠Panc02胰腺癌细胞株,通过检测荧光素酶活性,检测其表达效果,通过嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,挑选高表达荧光素酶基因的单克隆细胞株,并利用此细胞株在小动物活体成像系统中确认小鼠胰腺癌皮下肿瘤形成.结果 构建了表达荧光素酶基因的Panc02稳定转染细胞株,并且在体内形成皮下肿瘤.结论 构建了高表达荧光素酶基因的Panc02稳定转染细胞株.
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稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建
目的 构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株.方法 PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc-ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB-GLuc活性检测功能.构建逆转录病毒,感染HP14.5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB-GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达.结果 PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14.5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB-GLuc活性与免疫荧光结果一致.HP14.5 ALB-Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB-Gluc活性升高一致.结论 成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段.
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应用慢病毒系统建立高表达FTO蛋白的SV-HUC-1稳定细胞株
目的:构建慢病毒转染的肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)高表达体系,并建立稳定、高效、长久高表达FTO的人永生化膀胱移行上皮SV-HUC-1稳定细胞株,为研究FTO基因在膀胱癌发生及进展中的作用打下基础.方法:从SV-HUC-1细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA.以cDNA为模板应用PCR技术扩增FTO编码基因,将其连接入PLEX-puro表达载体(PLEX-puro-FTO),并转化至感受态大肠杆菌JM109中.对氨苄青霉素和博来霉素双重筛选的阳性克隆进行测序,鉴定插入正确后抽提质粒,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SV-HUC-1细胞,48小时后加入终浓度1μg/ml的嘌呤霉素进行药物筛选,10天后得到稳定细胞株,用Western blot测定转染后SV-HUC-1细胞中FTO蛋白的表达水平.结果:测序结果证实目的片断正确插入PLEX表达载体中,成功构建了PLEX-puro-FTO高表达载体;稳定转染高表达载体SV-HUC-1细胞的FTO蛋白表达显著高于转染空载体细胞.结论:成功构建了PLEX-puro-FTO重组慢病毒质粒,并获得FTO蛋白高表达的SV-HUC-1稳定细胞株.
