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端点条件对平行平板流动腔底部切应力的影响
高度远小于横向和纵向几何尺寸的平行平板流动腔是当前用以体外研究细胞在切应力场作用下的力学行为，特别是粘附特性的主要工具之一。本文对实际使用的具有不同入口和出口边界条件的流动腔内流体定常流动的流场进行详细分析，计算出几种常用的不同入口和出口流量分布所对应平行平板流动腔底部的切应力场分布，详细讨论端点条件对腔室底部切应力的影响情况，指出端点条件的影响只局限在离开腔室差不多为腔室宽度的区域之内，本文结果对于分析流动腔内细胞的力学行为和讨论切应力对细胞的影响有重要实际意义。
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层流剪应力对内皮细胞IL-8受体CXCR2蛋白表达的影响
目的 研究内皮细胞在不同时间、不同大小层流剪应力作用下IL-8 受体 CXCR2的表达规律.方法 通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.Hy926细胞,分别施加5.56、10.02、15.27 dyn/cm<'2>3种剪应力,以静止组为对照,选取0、1、2、4和8 h 5个时间点进行采样,West blot检测IL-8受体CXCR2表达变化.结果 在5.56 dyn/cm<'2>剪应力作用下,与静止组相比,CXCR2表达随作用时间的增加而显著升高(P<0.05),至4 h达到大值,为对照组的4.2倍.在10.02 dyn/cm<'2>剪应力作用下,CXCR2的表达随剪应力作用时间而相对缓慢增加,但仍高于对照组(P<0.05).在15.27 dyn/cm<'2>剪应力作用下,其CXCR2的表达随时间呈现较显著性降低(P<0.05),当持续作用8 h,其CXCR1的表达为对照组39.14%.结论 不同强度、作用时间的层流剪应力参与调节IL-8受体CXCR2的表达.
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平行板流动腔在靶向超声造影剂研究中的进展
近年来,靶向超声分子成像的发展十分迅猛,靶向超声造影剂在靶组织中的特异聚积程度是实现超声分子成像的关键,决定这种特异聚积程度的重要因素是靶向超声造影剂的靶向黏附效能.在评价靶向超声造影剂黏附效能的众多技术和方法中,新兴的平行板流动腔技术展示了其特有的优势,并被认为是体外评价靶向超声造影剂黏附效能有用的方法,本文就平行板流动腔在靶向超声造影剂研究中的进展作一概述.
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血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定
背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用，但重组A1在原核中多为包涵体表达，不利于纯化及体外的功能研究。
目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S，并研究其生物学功能。
方法：将血管性血友病因子A1(野生型)、血管性血友病因子G1324S(功能失去型突变体)重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中，筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌(E.coli)BL21、E.coli M15中，筛选挑单克隆菌于LB培养基，扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法，使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达，经过Ni柱亲和层析纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性；采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下，血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。
结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1，6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品，并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示，对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较，随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa，G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度(46.8%)要远高于野生型组(20.5%)，说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致，野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。 -
vWF-A1A2A3介导循环血小板翻滚运动的机制研究
目的 揭示血流剪应力对vWF-A1A2A3介导的循环血小板翻滚行为的调控机制.方法 利用平行平板流动腔实验技术,在不同流体剪应力条件下,观察和分析血小板在铺有200 μg/mL的A1A2A3流动腔底板上的翻滚黏附行为,提取细胞滚动特征参数.结果 血小板在底板vWF-A1 A2A3上的翻滚速度和时间、停留时间、停留频率和停留时间比率等参数均呈现双相力依赖的特性,剪应力阈值或拐点均发生在0.8 Pa左右；在剪切阈值水平之下,剪应力的增加可降低细胞滚动速度并增加滚动的稳定性.结论 流体壁面剪应力主要通过调节血小板在A1A2A3上的停留时间来影响其翻滚速度,提示相应的力学调节机制与GPIbα/A1A2A3黏附键从“逆锁键”向“滑移键”的转化过程相关.
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流动腔系统的研究进展
流动腔装置广泛用于体外研究流动环境中的细胞力学行为,是研究细胞粘附及应力与生长关系特性的主要手段之一.作者从流动腔系统的分类、数值模拟(包括后向台阶的流动腔数值模拟)、系统构建等三个方面对流动腔系统作一综述.
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线性变剪切流槽测定细胞在材料表面的黏附
本文介绍了一种平行板式线性变剪切流槽,其剪应力的大小沿流槽长度方向线性变化.这是基于两平行板间的Hele-Shaw 流理论.流槽厚度远小于流槽长度,而且是小雷诺数二维不可压缩流动,计算得出,从流槽入口到出口,流体剪应力呈线性递减.这样就实现了在一种流动腔中有不同的剪切力作用在细胞上,而不用改变流槽厚度和流量,大大提高实验效率.
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聚二甲基硅氧烷流动腔的构建与数值模拟
目的 构建动脉粥样硬化好发部位复杂血液流动状态的体外模型,并数值模拟.方法 利用软刻法制作带后向台阶的聚二甲基硅氧烷流动腔.采用有限元分析方法分析通道内的流型和剪切力分布.结果 获得了一个光学性能良好并能模拟体内特殊流型的流动腔,数值模拟显示,在流动腔中能产生流动停滞、涡流与再附流动等,形成了一个扰动流场.结论 该加工方法 快速、简便,制作的聚二甲基硅氧烷流动腔中流场的特征与体内动脉弯曲和分叉管处的血液流动相似,可进一步用于体外细胞力学行为的研究.
关键词： 流动腔 聚二甲基硅氧烷(PDMS) 数值模拟 计算机仿真 -
015 液体低切应力振荡流对血管内皮细胞转录因子NFκB的影响
目的: 核因子κB(NFκB)是一种具有多向性调节作用的蛋白分子, 存在于胞浆中, 一旦活化则可转位进胞核中与目标基因启动区域中特定序列结合而调控基因的转录. 在血管内皮细胞中NFκB参与白细胞粘附分子、 MCP-1、细胞因子等基因的转录调控. 已往工作已经证明, 流体低切应力振荡流动方式作用脐静脉内皮细胞可导致粘附分子VCAM-1表达上调, 这在动脉粥样硬化发生中起重要作用. 故进一步探讨这种VCAM-1的上调是否与NFκB参与调节相关. 方法: 接种的第二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)玻片置于平板流动腔中, 在无菌条件下连接到灌流系统, 调节流动腔隙的高度及灌流液速率达到所需切应力(0.2 Pa), 在此基础上, 用T形管连接一个偏心轮使液面在HUVEC表面来回摆动为振荡流, 这种流动方式作用于HUVEC 4 h后, 用细胞免疫化学方法测定EC的NFκB阳性率及阳性强度. 结果: 经振荡流作用后内皮细胞中NFκB阳性率明显增高、强度明显增加、分别为81.52%±10.65%和198.60±32.61(P<0.001), 处于静态EC为对照组, NFκB阳性率和强度分别为28.93%±14.06%和43.40±22.59, 经γTNF-α(5 ng/ml)处理内皮细胞阳性率为99.42%±0.84%, 阳性强度为277.23±23.26(P<0.001). 结论: EC经低切应力振荡流作用后明显增加NFκB的核转位, NFκB的活化能上调粘附分子的表达, 增加了在动脉粥样硬化易发部位单核和内皮细胞的粘附.
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016 不同流动方式的流体对血管内皮细胞粘附分子VCAM-1表达的影响
目的: 动脉粥样硬化(AS)早期病变易发生于动脉分叉及动脉弯曲处, 推测与血液流动方式有关: 此处血流呈低切应力摆动方式, 血管其它部位的血流呈稳层流方式. 单核细胞粘附于血管内膜, 进而穿过内膜迁移到内膜下成为巨噬泡沫细胞, 这是AS的病理基础的早期细胞行为, 细胞粘附分子的表达是细胞粘附的分子基础. VCAM-1是参与内皮和单核粘附的主要粘附分子之一, 了解不同血流方式对血管内皮细胞(VEC)粘附分子VCAM-1表达的影响, 有助于AS发生机制的阐明. 方法: 接种的第二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)玻片置于平板流动腔中, 在无菌条件下连接到灌流系统, 调节流动腔隙的高度及灌流液速率达到所需切应力(0.2 Pa), 此为稳层流, 在此基础上, 用T形管连接一个偏心轮使液面在HUVEC表面来回摆动为振荡流, 这两种流动方式作用于HUVEC 4、 18 h后, 用细胞免疫化学方法测定EC膜上VCAM-1表达. 结果: 低切应力振荡流4、 18 h细胞阳性表达百分率分别为14.83%±2.09%(n=6, P<0.01), 10.40%±2.28%(n=5, P<0.05), 稳层流4、 18 h, 分别为2.45%±0.47%(n=9, P<0.05), 4.98%±1.34%(n=9, P>0.05), 对照组为4.41%±0.59%(n=9), 阳性对照组(用TNF-α 5 ng/ml作用)为20.33%±3.01%(n=9, P<0.001). 结论: 同是低剪切应力, 由于流动方式不同, 细胞粘附分子VCAM-1表达不同, 振荡流可上调粘附分子VCAM-1表达, 促进细胞粘附发生, 为AS在局部形成提供了基础.
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硫化氢在低剪切应力导致内皮细胞自噬障碍中的作用
目的：探讨硫化氢在低剪切应力诱导的人脐静脉内皮细胞（ HUVECs）自噬障碍中的作用。方法：HUVECs经培养传代分为3组：对照组、低剪切应力组（5 dyn／cm2）和正常剪切应力组（15 dyn／cm2）。在平板流动腔上对内皮细胞进行剪切应力处理，Western blot检测CSE蛋白水平，RT－PCR检测CSE的mRNA含量，荧光显微镜MDC染色观察自噬表泡，免疫荧光检测LC3表达，Western blot检测Beclin1＼LC3＼p62蛋白水平，以评估不同剪切应力下，诱导HUVECs自噬障碍过程中内源性H2 S生成的变化。接下来用CSE干扰siRNA及CSE过表达质粒分别转染HUVECs后，再分别用5／15 dyne／cm2处理1 h，测自噬表达情况。结果：WB结果显示，与正常剪切应力组相比，低剪切应力组CSE表达明显减少。 Beclin1及LC3表达减少，p62表达增高，免疫荧光结果显示低剪切应力组LC3表达减少。提示低剪切应力组自噬障碍。结论：低剪切应力诱导的人脐静脉内皮细胞存在自噬障碍，其与CSE表达降低相关。
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体外血小板流动腔研究方法的建立和应用
目的 建立模拟体内血液流动环境下,实时观察、研究血小板与血管表面血管性假性血友病因子(vWF)相互作用的模型.方法 利用包被vWF的细玻璃管模拟血管,分别采用负压装置、蠕动泵和恒流注射泵产生不同流态和精确剪切率的流体环境,结合倒置显微镜和电荷耦合器件图像传感器(CCD,Charge-coupled device)实时观察和记录 血小板或细胞在流体作用下的一系列反应.结果 血小板和转染了血小板糖蛋白Ib-Ⅸ的中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamster ovary,CHO),在不同流态下都可与玻璃管壁上的vWF相互作用,从而介导血小板或CHO细胞与玻璃管壁的瞬时结合(滚动),并终牢固结合在玻璃管壁上.结论 本研究方法 可以在精确剪切率和不同流态的流体环境条件下,实时地观察、记录血小板与vWF相互作用的情况,为血小板各种生理功能的研究以及相关药物的研究应用创造条件.
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流动腔底面上内皮细胞图型化方法的初步研究
目的 体外模拟动脉粥样硬化好发部位复杂的血液流动状态,在流动腔底部形成微图型化的细胞,以获取单个细胞或确定点上细胞群的信息.方法 利用软刻法制作带后向台阶的PDMS流动腔和PDMS印章,再通过微接触压印在流动腔底部形成图型化的纤粘蛋白结构,细胞选择性生长在有蛋白的表面上.结果 获得了1个光学性能良好并能模拟体内特殊流形的流动腔及各种尺寸大小的印章,在腔底形成了纤粘蛋白图型和细胞小岛.结论 该加工方法快速、简便,制作的PDMS流动腔可进一步用于体外细胞力学行为的实时研究.
关键词： 流动腔 聚二甲基硅氧烷(PDMS) 图型化 微接触压印(μCP) 数字模拟 -
层流剪应力对内皮细胞IL-8受体CXCR1表达的影响
为研究内皮细胞在不同时间、不同大小层流剪应力作用下IL-8 受体CXCR1的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.Hy926细胞,分别施加5.56、10.02、15.27 dyn/cm2三种剪应力,选取剪切1、2、4和8 h等4个时间点进行观测,Western blot检测IL-8受体CXCR1表达变化.结果表明,在5.56 dyn/cm2剪应力作用下,与静止组相比, CXCR1表达随作用时间的增加而显著升高(P＜0.01),至4h达到大值,为对照组的2.2倍.在10.02 dyn/cm2剪应力作用下, CXCR1 的表达随剪应力作用时间而相对缓慢增加,但仍高于对照组(P＜0.05).在15.27 dyn/cm2剪应力作用下,其CXCR1的表达随时间呈现较显著性降低(P＜0.01),当持续作用8 h,其CXCR1的表达为对照组62.59%.以上结果表明,不同强度、作用时间的层流剪应力参与调节IL-8受体CXCR1的表达.
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一种PDMS制作的带有后向台阶的流动腔装置的构建及仿真
在研究血管动脉粥样硬化的成因中,带有后向台阶的流动腔装置能更好的体外模拟出血液的流动情况.不同于以往的流动腔的制作方法[1,2],现采用PDMS(聚二甲基硅氧烷Poly(dimethylsiloxane))软刻法制作流动腔装置[3,4].本文介绍了这种带有后向台阶的PDMS流动腔的制作过程以及模拟体外血液流动的一些情况,这有助于了解人体内动脉的分叉或弯曲部位血液流动情况.
