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流体剪应力作用下E-选择素介导的中性粒细胞钙响应
目的 探讨流场下E-选择素介导的中性粒细胞钙响应过程.方法 采用平行平板流动腔结合荧光显微镜,在0～600mPa流体剪应力(fluid shear stress,FSS)下,实时观察中性粒细胞在不同浓度E-选择素上的黏附及随后产生的钙响应.结果 在流场环境下E-选择素可特异性介导中性粒细胞的稳定黏附和钙响应,细胞的黏附数和激活比率随浓度的提高而逐渐增加.只有固定的E-选择素才能传递力信号来有效触发细胞的钙响应,FSS的增加不仅提高了细胞的激活比率(从23％增至70％),增加了钙响应的强度(从0.92增至1.45),而且大大缩短了细胞自黏附到钙响应启动的时间(从70s减为27s).结论 FSS和E-选择素协同调控中性粒细胞的钙响应,FSS对钙响应的速度和水平实行正向调节.研究结果可深化血流环境下白细胞免疫响应过程的理解.
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流体剪应力作用下VWF-A1A2A3介导的血小板P-选择素的原位表达
目的 探讨流体剪应力(fluid shear stress,FSS)对VWF-A1 A2A3介导的血小板表面P-选择素表达的影响.方法 利用平行平板流动腔实验系统,以CD62P:FITC作为血小板表面P-选择素表达的指示剂,采用荧光显微镜观察分析在不同FSS条件(0、1、2 Pa)下,血小板经由VWF-A1A2A3特异介导黏附后P-选择素表达随时间的变化过程,提取特征参数.结果 FSS扣动了血小板激活并产生P-选择素表达的扳机,激活比率受FSS大小和持续时间的正向调节,在1 Pa和2 Pa时的高激活比率分别为9.42％和14.59％;P-选择素表达水平随FSS作用时间的延长先提高后降低,呈现一个“双相”的变化过程,佳作用时间为7.5 min;P-选择素表达的荧光峰值随剪应力的增加而上升.结论 血小板P-选择素表达受FSS和VWF-A1 A2A3的协同调控,表达水平与力信号的持续时间相关.
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生理水平流体剪应力对三维多孔支架中成骨细胞力学敏感性及黏附、分化的影响
目的 构建可以达到生理剪应力水平的三维流动模型,研究流体剪应力对成骨细胞黏附、分化及力学敏感性的影响.方法 利用灌注式流动腔对生长在β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架内的MC3T3-E1成骨样细胞施加不同强度的流体剪应力6h,比较加载组和静态组的细胞活性表征细胞黏附;一氧化氮(NO)和碱性磷酸酶(ALP)表征力学敏感性和细胞分化.采用流固非线性耦合的数值计算,获得支架内各流量下的剪应力分布.结果 平均剪应力小于0.4 Pa,细胞的黏附率为74％～81％;0.41 Pa时,黏附率为60.22％.NO的产生率在加载后5 min达到大,15 min显著降低,30 min后产生率趋近于0.在0.232 ～ 0.304 Pa平均剪应力强度范围,ALP水平随着剪应力的升高显著增强(P＜0.01);而在0.304 ～ 0.412 Pa范围,剪应力增加对ALP水平的改变无显著影响(P＞0.05).结论 生理水平剪应力条件下,支架内大部分细胞可以维持正常黏附.三维条件下细胞力学敏感性与剪应力变化率成正比,与二维条件的规律相同.支架内平均剪应力小于0.304 Pa,剪应力显著促进细胞分化;大于这一剪应力,细胞分化水平不再明显变化.该研究有望加快骨组织工程的实现.
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流体剪应力在骨髓基质干细胞成骨向分化中作用机制的研究进展
细胞在体内受到流体剪应力、机械应变、流体静压力等机械应力的作用,其中流体剪应力(fluid shear stress,FSS)被认为是维持骨稳态及骨改建过程中重要的应力.目前研究多集中在FSS对骨细胞及成骨细胞的作用上,骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的研究相对较少.BMSCs对骨改建及治疗具有重要的意义,BMSCs对FSS的应答越来越受到关注.BMSCs对FSS的反应涉及细胞骨架、基质刚度及弹性、成骨信号等方面.总结FSS在BMSCs内的力转导机制、对其分化及功能的改变等方面的研究进展,为今后构建组织工程化骨、骨病变的治疗等研究提供思路.
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线性变剪切流槽测定细胞在材料表面的黏附
本文介绍了一种平行板式线性变剪切流槽,其剪应力的大小沿流槽长度方向线性变化.这是基于两平行板间的Hele-Shaw 流理论.流槽厚度远小于流槽长度,而且是小雷诺数二维不可压缩流动,计算得出,从流槽入口到出口,流体剪应力呈线性递减.这样就实现了在一种流动腔中有不同的剪切力作用在细胞上,而不用改变流槽厚度和流量,大大提高实验效率.
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灌流式生物反应器内支架材料孔隙流场和壁面剪应力的数值分析
为获得支架材料孔隙受到的壁面剪应力的大小及分布、孔隙内压力分布以及支架材料与灌流小室之间不同缝隙时的灌流率.根据有限元方法建立了灌流式生物反应器小室内3种支架材料孔隙模型,用ansys软件分析了各种模型在不同工况下的灌流情况.结果表明,支架材料与灌流小室之间的孔隙决定灌流率,缝隙大于0.5mm时灌流率小于60%;支架材料孔隙壁面剪应力大小主要受灌流流量的影响,调节灌流流量是控制剪应力水平的主要手段.孔壁剪应力和孔内流体压力的分布均由支架材料孔隙的形状特征所决定.
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前列腺素E2对成骨细胞微丝强度的调控作用
目的 观察前列腺素E2(PGE2)在受到流体剪应力(FSS)加载后的MC3T3-E1成骨细胞株中对微丝强度的调控作用,并且探讨相关机制.方法 使用荧光标记法对经过FSS加载以及空白试剂、16,16-二甲基前列腺素E2(dmPGE2)、dmPGE2+蛋白激酶A肽抑制剂(PKI)、8溴-环单磷酸腺苷(8Br-cAMP)、8Br-cAMP+ PKI处理后的MC3T3-E1细胞中微丝进行染色处理;并通过图像处理软件(Volocity)对细胞中连续微丝的比例进行量化,检测dmPGE2对细胞中微丝强度的调控作用以及蛋白激酶A(PKA)信号通路的参与作用.结果 相对于空白对照组,dmPGE2显著降低了FSS加载后MC3T3-E1细胞中的微丝的强度.PKA信号通路的激活剂8Br-cAMP在一定程度上模拟了dmPGE2对微丝的作用;PKA信号通路阻滞剂PKI削弱了dmPGE2的作用.结论 dmPGE2能够促进FSS加载后MC3T3-E1细胞中微丝强度向静态水平的恢复;并且发现PKA信号通路参与此调控过程.
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细胞体外流体剪切力加载装置平行平板流室的合理设计与应用
[目的]不同形式的剪切力作用对维持细胞、组织及机体正常生理状态有重要意义,合适的加载装置是细胞力学研究的前提.参照传统平行平板流室的理论和方法,研究适用于体外细胞的流体剪切力加载装置.[方法]设计制作平行平板流室加载装置,通过多普勒超声测速技术对流室流速等流体特征进行检测;并通过对小鼠成骨细胞的加载实验,检测装置的可行性与可操作性.[结果]彩色多普勒检测结果显示该装置内流体流动较均匀,剪切力加载均匀准确,操作简单方便.[结论]本研究装置可用于体外研究成骨细胞等力学敏感细胞在形态学、生理生化等方面对剪切力的反应.
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流体剪应力对成骨细胞的作用研究
研究了生理范围内不同大小的流体剪切力对成骨细胞增殖分化和功能的影响,从细胞水平验证流体剪切力在骨组织力学适应性中发挥的重要作用.运用流室系统提供精确可控的流体剪切力,对原代培养的大鼠颅骨成骨细胞施以5、10、20、30 mN/cm2的剪切力刺激,分别在加载后的3、6、9、12、24、36 h采集样品,检测细胞周期分布,碱性磷酸酶活性,胞外钙质分泌的变化.5 mN/cm2和10 mN/cm2的剪应力促进细胞增殖,进一步增大会有抑制作用,而5、10和20 mN/cm2的剪应力对ALP活性和胞外钙分泌均有促进作用,并且与静态培养相比ALP活性高峰期提前,30 mN/cm2表现出抑制效应.结果显示成骨细胞的增殖、分化、矿化均能受到剪应力的调节,这种调节表现出对剪应力大小的依赖性.
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流体剪应力作用于间充质干细胞对其诱导内皮分化后抗氧化能力的影响
探讨流体剪应力对间充质干细胞(MSCs)诱导的内皮细胞抗氧化能力的影响.体外培养大鼠骨髓MSCs,于流室中加载不同强度的流体剪应力,加载后向内皮细胞系诱导,检测所得细胞总抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)生成量的变化.流体剪应力对MSCs体外诱导所得内皮细胞的总T-AOC、NO均有上调作用,并呈强度依赖关系.流体剪应力对骨髓MSCs体外诱导培养的内皮细胞具有保护性作用,为缺血性心脏病的细胞治疗及心血管组织工程提供了理论基础.
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流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响
探讨流体剪应力对大鼠破骨细胞骨吸收活性的影响.我们采用低温离心法获取6月龄健康雌性SD大鼠椎骨骨髓细胞,以1.6×106细胞密度种植于血盖片上,采用1,25-(OH)2维生素D3体外诱导获取破骨细胞.于破骨细胞诱导的第7 d取出细胞爬片,置于流体剪应力装置中,分别加载5.97、11.36、16.08、20.54 dyne/cm2大小的流体剪应力,持续30 min,以未加载流体剪应力的破骨细胞为对照组.实验结束时,以2.5%戊二醛固定细胞爬片,置于0.25 mol/L氢氧化铵液超声处理10 min,清除细胞爬片上的破骨细胞,经1%硪酸固定,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯置换酒精,CO2临界点干燥,喷金后扫描电镜观察骨吸收陷窝并计数,图像分析法测定骨吸收陷窝的面积;同时分别收集每次灌流液10 ml,冻干,用1 ml复溶后,紫外分光光度仪检测抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)活性的变化.结果显示:在本实验中所选用的流体剪应力可增强破骨细胞TRAP活性,而骨吸收陷窝的数量和面积也增加,尤其是剪应力在16.08 dyne/cm2时,破骨细胞TRAP活性增强以及骨吸收陷窝的数量和面积增高为明显.结果表明,一定范围内的流体剪应力可以增强破骨细胞的骨吸收活性.
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流体剪应力对EA.Hy926细胞IL-8受体mRNA表达的影响
为研究EA.Hy926细胞在不同时间、不同大小流体剪应力作用下IL-8受体CXCR1、CXCR2 mRNA的表达规律,通过体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.Hy926细胞,分别施加5.56、10.02、15.27 dyn/cm2三种剪应力,选取剪切5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min、1、2、4和8 h等10个时间点进行观测,以半定量RTPCR方法检测IL-8受体mRNA表达变化.结果表明,在5.56 dyn/cm2剪应力作用下,与静止组相比,各时间点CXCR1 mRNA与CXCR2 mRNA表达均显著升高(P＜0.05).在10.02 dyn/cm2剪应力作用下,CXCR1 mRNA表达随时间相对缓慢下降;而CXCR2 mRNA表达在30min出现短暂的升高,然后随着作用时间的延长开始缓慢下降.在15.27 dyn/cm2剪应力作用下,其CXCR1、CXCR2 mRNA的表达随时间呈现较显著性降低(P＜0.01),当持续作用4 h以上其CXCR2 mRNA表达极低.以上结果表明,不同强度、作用时间的流体剪应力参与调节IL-8受体表达.
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可用于体外培养破骨细胞的流体剪应力系统
基于传统的平行平板流室理论和方法,设计制作一套可用于破骨细胞等细胞经受流体剪应力作用的实验系统.用金属夹具和医用硅橡胶密封圈封闭流室,同时不影响流室高度的准确性.调整载玻片与上储液池液面到同一水平面,降低了液体静压力对细胞的影响.此系统可用于研究破骨细胞等细胞在形态学、生理生化等方面对剪应力的反应.
