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2例类孟买表型的分子机理研究
本研究探讨2例类孟买血型表型的分子机理.先证者样本通过血清学方法鉴定为类孟买血型,采用PCR扩增先证者的FUT1和FUT2基因编码区序列,并对PCR产物进行直接测序分析.同时FUT1基因PCR产物经TOPO TA转染克隆到质粒上分离后,对其进行测序分析,以证实突变在染色体上的位置.结果表明:直接测序发现2例先证者FUT1基因第547-552位AG两碱基缺失杂合(CAGAGAG→CAGAG)和第658位C→T杂合.克隆后证实一条染色体上FUT1基因第547-552位中的两碱基AG缺失,可导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码;另一条染色体上FUT1基因第658位C→T错义突变,导致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys).2例先证者FUT2基因均为357C→T同义突变.结论:2例先证者FUT1基因突变为不同染色体的复合性突变,均为h1h3.
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FUT1基因杂合或纯合突变致类孟买血型形成研究
本研究旨在探讨类孟买血型表型形成的分子机制.采用血清学方法鉴定个体红细胞H抗原；采用高保真PCR扩增检测个体的α1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)基因编码区序列,并进行测序、比对分析,以查明个体类孟买血型的发生机制.结果表明:凝胶电泳分析证实成功扩增FUT1基因编码区全长序列;克隆后测序、比对发现:个体1的1条染色体上FUT1基因为h1 (547-552delAG),另1条染色体上为h4(35C＞ T),为h1h4杂合子;个体2,3的2条染色体上FUT1基因均为h1 (547-552delAG),为h1h1纯合子.结论:FUT1基因杂合或纯合突变均可致类孟买血型的发生.
关键词： 类孟买血型 α1 2岩藻糖基转移酶 FUT1基因杂合突变 FUT1基因纯合突变 -
一例类孟买型表型的分子机理研究
为了研究1例类孟买型的分子机理,在血清学方法初步鉴定先证者为A类孟买型的基础上,用PCR扩增先证者ABO基因第6、7外显子、FUT1基因(H)和FUT2基因(Se)的编码区序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序分析,并应用PCR-SSP和基因扫描方法证实测序所发现的突变.FUT1基因突变通过克隆到质粒载体后测序分析.结果表明:直接测序发现先证者ABO血型基因型为A102A102,FUT1基因第682位A→G错义突变、第547-552位两碱基AG缺失(CAGAGAG→CAGAG)突变.克隆证实1条染色体上FUT1基因为A682G突变,导致M228V氨基酸突变;另一条染色体上第547-552位两碱基AG缺失,导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码.FUT2基因为分泌基因Se357和弱分泌基因Se357,385杂合(第357位为T/T纯合,385位为A/T杂合).结论:FUT1基因A682G和547-552 delAG双杂合突变是引起该例先证者表现为类孟买型的分子机理,A682G是一个新的引起类孟买型的FUT1基因突变.
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异种移植模型转人α1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备
目的制备转人α1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段.方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HT cDNA全长序列,两端含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切纯化质粒鉴定;EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-HT cDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HT cDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;Pvu Ⅰ和Not Ⅰ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HT cDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液.结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HT cDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段.结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠.
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高效液相色谱法测定α1,2岩藻糖基转移酶活性
目的:利用反相高效液相色谱技术建立α1,2岩藻糖基转移酶活性的测定方法.方法:反应混合物处理后进样,以90%的20 mmol/L KH<,2>PO<,4>(含5%四丁基溴化铵)和10%甲醇为流动相,254 nm波长下检测底物β-苯酰半乳糖苷的减少量.结果:方法回收率≥97%,变异系数为1.66%,准确度和精密度都较高.β-苯酰半乳糖苷峰单一,无其它杂峰干扰.反应管与对照管相比,β-苯酰半乳糖含量明显降低.结论:建立的反相高效液相色谱法测定α-1,2岩藻糖基转移酶方法可靠,适合于常规检测和体外表达研究.
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10例类孟买表型α1,2岩藻糖基转移酶基因序列分析
目的:分析10例类孟买血型表型的α1,2岩藻糖基转移酶基因序列情况.方法:ABO、H抗原检测采用血清学方法.利用PCR技术扩增FUT1编码区序列,PCR产物双酶切后直接测序分析.杂合子突变标本采用TOPO TA技术分离得到单链.结果:类孟买血型表型红细胞缺乏H抗原,与抗H试剂不凝集.10例标本直接测定FUT1基因编码区序列,3例为第547-552位AG两碱基缺失(CAGAGAG→CAGAG)纯合子,其它7例为有不同突变点的杂合子.单体型分析显示存在235C、293T、547-552delAG、658T、35T+682G、880-882delTT等6种单体型.结论:类孟买血型存在多种分子遗传机制,常见单体型为547-552delAG.
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一个类孟买血型家系的α1,2岩藻糖基转移酶基因突变分析
目的 研究1个中国人类孟买型血型家系的分子遗传背景.方法 以血型血清学方法鉴定先证者及其家系的红细胞ABO和H表型,应用聚合酶链反应扩增类孟买表型家系的ABO基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-fucosyltransferase,FUT1)编码区,PCR产物直接测序分析,并通过克隆测序法对存在FUT1基因复合杂合的样本进行单倍体序列分析.结果 通过血清学技术在9个家系成员中鉴定了3个类孟买型,直接测序发现先证者FUT1基因存在35C/T、235G/C和682A/G复合杂合.单倍体序列分析表明先证者的FUT1基因型为h235c/h35T+628G.其中h235C等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶G79R替换,h35+628G等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶A12V和M228V替换.结论 在中国人群中发现一种新的类孟买表型相关的FUT1基因突变235G>C.
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中国人群中α1,2岩藻糖基转移酶基因C35T变异的频率研究
目的研究中国人群中α1,2岩藻糖基转移酶(alpha-1,2-fucosyltransferase,FUT1)基因FUT1 C35T变异的等位基因频率.方法聚合酶链反应扩增包括C35T变异区域的FUT1基因DNA片段,扩增产物用HaeⅢ进行酶切,建立鉴定FUT1基因h4等位基因的PCR-限制性片段长度多态性方法.应用该方法对158名随机汉族人群样本进行检测.结果 158名随机样本中,35T/T纯合子8名,35C/T杂合子67名,35C/C纯合子83名,符合Hardy-Weinberg遗传平衡.所有样本的ABO血型鉴定均正常,而非H缺陷.结论 FUT1基因C35T不是引起类孟买型的基因突变,而是一种常见的基因多态性.
关键词： α1 2岩藻糖基转移酶基因 h4等位基因 2岩藻糖基转移酶 类孟买型表型 -
一例类孟买血型的家系分析和分子机制研究
目的 对1例类孟买血型个体及其家系进行表型鉴定和分子机制研究.方法 应用血清学方法检测ABO、H抗原；应用PCR技术扩增FUT1编码区序列.PCR产物经双酶切后进行直接测序分析.结果 先证者红细胞与抗H血清不凝集,血清学鉴定为Bmh.直接测序显示其FUT1基因编码区序列第547-552位A、G两碱基为纯合型缺失(CAGAGAG-CAGAG),第814位为A/G杂合,因此推测其单倍型分别为547 552delAG、547-552 delAG和814A＞G复合突变.先证者母亲、姐姐、妹妹血型均为B型,母亲、姐姐的FUT1基因分别为814A/G杂合和547-552 del/AG杂合,而妹妹为FUT1 547-552 del/AG杂合.先证者的FUT1 547-552 AG缺失和814A＞G复合突变均遗传自母亲.结论 在类孟买血型个体中首次发现FUT1 547-552delAG和814A＞G复合突变.
