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荧光定量PCR检测Rh阴性孕妇外周血浆游离DNA中胎儿RhD血型
目的 探讨荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术对Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行非创性产前诊断胎儿RhD血型的可行性.方法 选取78份妊娠11～40周、B超确诊为单胎的Rh阴性孕妇血浆.采用9个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)多态性位点及Y染色体性别决定区基因(sex-determining region Y chromosome,SRY)确定胎儿DNA的存在;运用FQ-PCR技术对血浆中游离胎儿DNA进行RHD基因外显子5、7、10和内含子4定量分析,以确定胎儿RhD血型的基因型;其基因型结果与产后新生儿脐血血清学检测结果进行对比分析,回顾性评价胎儿基因定型结果的准确性.结果 78份标本中,41份检测到SRY基因,平均浓度为(214.7±120.9)拷贝/ml,产后证实皆为男性.70份FQ-PCR基因定型结果与血清学结果相符,另有5份确定为假阳性,3份基因定型结果不可确定,检测结果总符合率为90%(70/78).5份假阳性标本通过检测RHD1227A等位基因鉴定了4份RhD放散型,FQ-PCR终结果准确率达到95%(74/78).结论应用FQ-PCR方法进行非创性胎儿RhD血型检测可用于新生儿溶血病的预防和诊断.
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人Rh(D)血型抗原模拟表位的筛选和鉴定
目的 从噬菌体随机肽库中筛选人Rh(D)血型抗原模拟表位,并对其免疫学活性进行鉴定.方法 以抗Rh(D)单克隆抗体作为固相筛选分子,对噬菌体随机十二肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选35个克隆,经噬菌体ELISA和交叉反应试验,确定阳性克隆,再对这些克隆进行DNA序列测定和抗体竞争抑制试验,以获取人Rh(D)血型抗原模拟表位.然后采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)对所获噬菌体进行鉴定和抗原性分析.结果 经过3轮淘洗后,噬菌体得到富集,获得11个阳性克隆.DNA序列测定和竞争抑制实验结果表明,这11个克隆噬菌体所展示的外源多肽中有7个克隆氨基酸序列含有相同的色氨酸(W)、脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)结构(-WP-Q-),且均具有40%以上的抑制率;其余4个克隆没有共性,抑制率较低,可能为非特异性结合.Western blot分析表明,被选定的噬菌体能被抗Rh(D)血清特异识别,具有类似于Rh(D)蛋白的抗原性.结论 利用抗Rh(D)单克隆抗体筛选噬菌体随机肽库,成功获得含有(-WP-Q-)结构的Rh(D)抗原模拟表位,为进一步探讨Rh(D)新生儿溶血病的发病机制和疫苗的研究奠定基础.
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RHD基因测序方法的建立及其在弱D表型分子鉴定中的应用
目的建立RHD基因的测序方法并对9例弱D表型作分子鉴定.方法用间接抗人球蛋白试验(IAT)筛选弱表达的D变异体,聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列,PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异.结果用PCR-SSP方法特异扩增RHD基因,50份随机Rh阴性(ccdee)样本呈阴性结果,51例随机Rh阳性样本呈阳性结果.扩增产物测序结果表明,15份代表性Rh阳性单倍体型的RHD基因序列和标准序列一致.用所建立的方法对9份弱D表型样本进行测序分析,发现5份有845G＞A突变,3份有1 227G＞A突变,1例有1013T＞C突变.结论所建立的RHD基因测序方法可以用于弱D的分子鉴定.9份弱D表型的分子机理得到明确.
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双管聚合酶链反应技术在检测RHD基因中的应用
目的探讨采用简易的分子生物学方法检测RHD 基因纯合子和杂合子的有效性.方法按美国基因序列数据库中的RHD 盒子序列设计两对引物,分别检测RHD 基因下游盒子和融合盒子,并引入一对内对照引物,建立双管聚合酶链反应(PCR)技术用于检测RHD 基因合子型.同时以经典的限制性片段长度多态性(RFLP)方法作对照.共检测30份Rh血型D抗原(RhD)阳性、阴性及弱D表型个体的全血DNA样品.结果 30份血DNA样品中, 29份样品双管PCR法和RFLP法检测结果完全一致,并分别与样品的血清学血型相吻合;对其中的1例弱D表型血DNA样品,PCR和RFLP法均鉴定为RHD阴性纯合型(RHD-/RHD-),显示该个体拥有一条RHD-单倍体,但RHD下游盒子检测出现假阴性.结论双管PCR法是简易而有效的基因检测方法,可用于RHD合子型鉴定,在临床上可以预测胎儿的RhD血型.
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母婴Rh血型不合胎儿和新生儿溶血病相关临床问题研究
母婴Rh血型不合胎儿和新生儿溶血病(Rh-HDFN),是胎儿或新生儿同种被动免疫溶血性贫血常见原因之一.Rh-HDFN导致的胎儿或新生儿病情危重,可引起胎儿严重贫血、水肿、心力衰竭、死胎,或导致新生儿核黄疸及死亡等,而幸存Rh-HDFN新生儿,则可能遗留智力发育不全、运动功能障碍等神经系统后遗症.临床对于Rh-HDFN的早期诊断、及时治疗与胎儿及新生儿预后的关系紧密相关.Rh-HDFN的产前预防,越来越受到产科临床的关注.笔者拟针对Rh-HDFN临床相关问题的新研究进展进行阐述.
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应用Rh阴性孕妇外周血胎儿游离DNA进行RhD血型产前基因诊断
目的 探讨利用Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿RhD血型的方法.方法 通过SRY基因确定胎儿DNA的存在,采用PCR-SSP技术对32例妊娠11～40周的单胎RhD阴性孕妇血浆中胎儿游离DNA进行RHD基因外显子5、7、10和内含子4的特异性扩增,其基因型结果与产后新生儿脐血血清学检测结果进行对比性分析,回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性.结果 32例样本中,28例基因定型结果与血清学表型相符,准确率达到87.5%,通过检测RHD1227A等位基因鉴定了RhD放散型,使结果达到93.75%(30/32)的准确率.结论 利用Rh阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性诊断胎儿RhD血型,是一种简便、快速且无损伤性的产前基因诊断的可行性方法,可用于新生儿溶血病的预防和诊断,值得临床推广应用.
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32例RhD阴性孕妇产前胎-母免疫状态分析
目的探讨RhD阴性孕妇产生抗-D抗体的影响因素及与Rh新生儿溶血病的关系. 方法对32例RhD阴性孕妇及其新生儿进行D抗原的间接抗人球蛋白实验和红细胞D抗原的吸收发散实验,并采用聚合酶链式反应(PCR)技术和DNA序列分析技术分析弱D表型孕妇的RHD基因型,同时采用流式细胞术,分析多次妊娠的RhD阴性孕妇的胎-母出血状况. 结果在32例初筛RhD阴性孕妇中,18例孕妇妊娠两次以上.在这18例中,有3例为Del表型,1例为部分DVI Ⅲ型,其余14例真实RhD阴性孕妇中有2例产生抗-D抗体,13例在其外周血中,应用流式细胞术检测到胎儿红细胞.初次妊娠的RhD阴性孕妇均未检测到抗-D抗体. 结论在初次妊娠的RhD阴性孕妇中,抗-D同种免疫少见;14.3%多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体,导致Rh新生儿溶血病发生;未观察到DVI Ⅲ型和Del表型个体产生抗-D免疫反应.
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新生儿Rh血型不合溶血病90例临床分析
目的 分析新生儿Rh血型不合溶血病(简称Rh溶血病)的临床特征及预后,提高对新生儿Rh溶血病的认识. 方法 研究对象为1995年1月1日至2010年12月31日首都医科大学附属北京儿童医院收治的符合新生儿Rh溶血病诊断标准的患儿,回顾性分析其临床资料.对患儿进行脑干听觉诱发反应测定听力,根据结果分为听力异常组和听力正常组,比较2组的人院日龄、黄疸出现时间、黄疸持续时间、血胆红素峰值、血总胆红素/白蛋白比值、入院体重与出生体重的差值.体重下降百分比指体重下降值(g)/出生体重(g)×100％.采用Gesell测定或韦氏儿童智力测定进行远期随访.采用t检验、x2检验及独立样本秩和检验进行统计学分析. 结果 符合新生儿Rh溶血病诊断标准的患儿共90例,其中80例(89％)在生后24 h内出现黄疸,70例(78％)的血胆红素峰值＞220.6μmol/L,59例(66％)为抗D引起的新生儿Rh溶血病,90例直接Coombs试验均为阳性.听力异常组(n=31)与听力正常组(n=59)患儿的入院日龄[(2.3±1.6)与(2.4±3.1)d]、生后出现黄疸时间[13 h(4～18 h)与12h(6～21 h)]、黄疸持续时间[13 h(8～43 h)与24h (9～53h)]、出生体重[(3 188±402)与(3 168±448)g]、入院体重[(3 344±492)与(3 244±451)g]比较,差异均无统计学意义(t或Z值分别为-0.27、-0.03、-0.47、-1.47和-0.75,P值均＞0.05).听力异常组与听力正常组患儿的血胆红素峰值分别为(408.5±181.2)与(313.9±127.6)μmol/L,血总胆红素/白蛋白比值分别为12.7±5.3与9.1±4.l,听力异常组均高于听力正常组,差异均有统计学意义(t值分别为2.59和2.89,P值均＜0.05).听力异常组和听力正常组中体重下降患儿(n分别为21和35)的体重下降百分比分别为(6.6±5.0)％与(5.6±2.9)％,听力异常组高于听力正常组,差异有统计学意义(t=4.06,P＜0.05).对8例患儿进行远期随访,3例智力筛查异常的患儿均在生后6h内出现黄疸,其中2例的母亲既往有不良产史. 结论 新生儿Rh溶血病发病早,黄疸程度重;血胆红素峰值、血总胆红素/白蛋白比值较高者,可能更易出现听力异常.
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MN与Rh系统新生儿溶血病的临床特点比较
目的：总结并比较新生儿MN及Rh溶血病的临床特点。方法首都医科大学附属北京儿童医院新生儿科2011年2月至2015年1月临床诊断新生儿MN溶血病3例、Rh溶血病64例，回顾分析其临床资料。检索及复习万方数据库、中国知网数据库1992年至2014年文献报道的临床资料相对完整的新生儿MN溶血病病例共28例。采用χ2检验或Fisher精确概率法比较MN和Rh溶血病的临床特点。结果经过积极对症治疗，64例Rh溶血病患儿中2例因胆红素脑病放弃治疗，31例MN溶血病患儿中2例（文献报道病例）因严重贫血、水肿于生后24 h内死亡，其余均存活出院。MN溶血病发生在第1胎的比例高于Rh溶血病[26%（8/31）与9%（6/64），χ2=4.487，P=0.034]，但黄疸发生率[81%（25/31）与98%（63/64），χ2=9.686，P=0.002]、生后24 h内出现黄疸的比例[29%（9/31）与64%（41/64），χ2=10.279，P=0.001]及直接抗人球蛋白试验阳性率[39%（12/31）与100%（64/64），Fisher精确概率法，P=0.000]低于Rh溶血病。MN溶血病患儿高胆红素血症[58%（18/31）与66%（42/64），χ2=0.513]、重度高胆红素血症[23%（7/31）与36%（23/64），χ2=1.724]、贫血[81%（25/31）与89%（57/64），χ2=1.253]及重度贫血的发生率[29%（9/31）与34%（22/64），χ2=0.271]与Rh溶血病患儿差异无统计学意义（P值均＞0.05）。结论 MN及Rh溶血病新生儿通常临床表现严重，有明显贫血和/或黄疸。当直接抗人球蛋白试验阴性时，尤其要关注MN溶血病，及时查母间接抗人球蛋白试验有利于诊断。
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北海市人群Rh血型调查报告
RhD阴性血型属稀有血型,我国汉族人发生频率<1% [1].在临床工作中常因Rh阴性血型血源供应困难而影响临床抢救治疗.北海市Rh血型的调查目前尚属空白.为了掌握北海市人群RhD阴性血型的分布和频率,建立Rh阴性血型档案,为成立Rh阴性血型的献血队伍提供帮助,我们于2000年5月开始在全市范围内进行了Rh血型的调查,现报道如下.
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无创产前诊断RhD阴性孕妇胎儿RhD基因型敏感度和特异度的荟萃分析
目的 探讨无创产前诊断对RhD阴性孕妇胎儿RhD基因型诊断的敏感度和特异度及该方法在临床上施行的可行性.方法 检索PubMed、Embase、Web of Science数据库中的文献,按照诊断试验的纳入和排除标准筛选文献,提取纳入文献的特征信息.应用MetaDisc1.4软件对符合条件的研究结果进行荟萃分析.结果 共纳入55篇文献,胎儿17 138例,研究间具有异质性,采用随机效应模型,汇总敏感度、特异度和ROC曲线下的面积分别为98.5％、97.3％和0.994.对纳入的文献进行亚组分析和敏感度分析.样本量＜100的25篇文献敏感度(94.6％)低于样本量100～300的19篇文献(98.5％)和样本量＞ 100的11篇文献(99.0％),差异有统计学意义(x2=36.800、106.062,P＜0.05),样本量100～ 300的研究组和样本量＞300的研究组敏感度(98.5％、99.0％)差异无统计学意义(x2 =3.068,P＞0.05).结论 无创产前诊断胎儿RhD基因型的敏感度和特异度较高,可用于Rh阴性孕妇胎儿的Rh基因型的产前诊断,预防新生儿溶血症的发生.
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一种新的RHD合子型直接测定方法
目的建立简易的RHD合子型直接测定方法.方法根据RHD基因序列和RHD基因缺失的原理设计两对引物,分别特异性针对RHD基因第一外显子和融合Rh盒子,再引入一对内对照引物,建立新的双管复式PCR方法;并用于检测152份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本、以及359份已知Rh表型样本的RHD合子型.检测结果与使用近期报道的限制性片段长度多态性(RFLP)技术的鉴定结果相比较.结果 152份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本包括92份Rh阴性、28份D放散型、3例部分D表型、5例弱D型及24例Rh阳性样品,全部样品的RHD合子型PCR检测结果均与已知的基因型相符合,可直接判断RHD(+)/RHD(+)、RHD(+)/RHD(-)和RHD(-)/RHD(-)三种合子型;359份已知Rh表型的样本,包括12例孕妇配偶、18名家系成员、48例Rh阴性及281例Rh阳性捐血者,PCR检测结果,除一例外,均与RFLP结果一致.该个例PCR检测为RHD(+)/RHD(-)杂合型,而RFLP结果为RHD(-)/RH1D(-)纯合型,由于个例为Rh阳性表型,肯定存在至少一条RHD基因,所以显然RFLP检测下游Rh盒子出现假阴性.结论双管PCR技术鉴定RHD合子型,简便、快速,具有较高的准确率,可常规用于临床或血库实验室.
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Rh阴性孕妇妊娠结局的Meta分析
目的:分析Rh阴性孕妇的妊娠结局.方法:计算机检索中国知网、维普、万方、PubMed和Embase数据库,搜集有关Rh阴性孕妇妊娠结局的相关研究,检索时间均为1980年1月1日—2018年1月30日.由2名研究者按照纳入与排除标准筛选文献、提取资料和评价纳入研究的质量,采用RevMan 5.3软件进行Meta分析.结果:共纳入9篇文献,共4122例研究对象,其中Rh阴性孕妇组679例,Rh阳性孕妇组3443例.Meta分析结果显示,Rh阴性孕妇组新生儿高胆红素血症(RR=6.29,95％CI:3.64～10.85,P<0.00001)和早产(RR=3.05,95％CI:1.80～5.15,P<0.0001)的发生率均高于Rh阳性孕妇组.结论:Rh阴性孕妇发生新生儿高胆红素血症和早产的风险较高.因此,对Rh阴性孕妇要加强孕期监护,定期监测Rh抗体,以降低围生儿的各种并发症.
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Rh(D)阴性患者抗原抗体的检测及临床输血
Rh血型系统是仅次于ABO系统的具有临床意义的血型抗原.D和CcDE是常见的人类Rh抗原.他们能刺激机体产生自身或同种抗体并引起新生儿溶血病、溶血性输血反应或自身溶血性贫血.其中D抗原具免疫原性,因此以抗D抗体较为多见.主要是Rh(D)阴性患者通过输血、妊娠或其他不明原因的免疫作用产生抗体,极少见自然发生的抗体,自身免疫溶血性疾病患者体内可发现Rh自身抗体.笔者对天津地区部分Rh(D)阴性患者的抗原及产生抗体情况报告如下.
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抗-E及抗-Ec合并抗-Fyb致新生儿溶血症二例及文献复习
新生儿溶血病(HDN)在妊娠早期可引起流产、早产、胎儿水肿、胎儿宫内贫血甚至胎儿死亡;新生儿可出现黄疸、贫血、肝脾肿大、水肿、核黄疸后遗症等.本文回顾了抗-E及抗-Ec合并抗-Fyb致新生儿溶血症2例患者的诊疗经过,并复习了该病流行病学情况、诊断及治疗的相关文献资料,以提高对本病的认识.
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Rh(D)阴性血型病人剖宫产术中成分式自体输血的安全性
目的 评价Rh(D)阴性血型病人剖宫产术中成分式自体输血的安全性.方法 拟行剖宫产术的Rh(D)阴性血型病人30例,年龄20～35岁,体重50～80 kg,ASA分级Ⅰ或Ⅱ级.静脉输注乳酸钠林格氏液7 ml/kg后经桡动脉采血,采血速率60～80 ml/min,采血同时静脉输注与采血等速率的6%羟乙基淀粉130/0.4.采集的自体血经2个循环的直接法分离为富含血小板血浆、贫血小板血浆和浓缩红细胞,每个循环以分离出红细胞后15 s时停止采血.出血量≥全身血容量的20%时立即回输自体血;出血量<全身血容量20%者,在缝合子宫后回输,依次回输富含血小板血浆、输贫血小板血浆和输浓缩红细胞.监测母体生命体征指标和胎儿心率.记录自体血采集过程中低血压和心动过速的发生情况.分别于采血前(基础状态)、采血结束时、自体血回输前和术后24 h时采集外周静脉血样,测定Hb、Hct、Plt、PT、APTT、INR和Fib.胎儿娩出后采集脐动脉血样,进行血气分析.于胎儿娩出后1、5min时行Apgar评分.记录术中出血量和异体输血情况.结果 自体血采集过程中未见低血压和心动过速的发生,胎儿HR维持在正常范围.与基础状态比较,其他时点SpO2、Hb、Hct、Plt、PT、APTT、INR和Fib差异无统计学意义(P>0.05).脐动脉血pH值、BE和乳酸浓度均在正常范围内.胎儿娩出后1、5 min时Apgar评分分别为(9.0±0.8)、(9.2±0.8)分;术中出血量(405±28)ml,所有病人未输注异体血.结论 Rh(D)阴性血型病人剖宫产术中成分式自体输血的安全性良好.
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DU型妇女多胎致抗-D引起新生儿溶血病
Rh(D)阴性产妇常因母婴血型不合,引起婴儿发生Rh新生儿溶血病(HDN),且随分娩次数的增加逐胎加重,现就1例DU型产妇多胎致抗-D引起新生儿溶血病分析报告如下.
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军队血站Rh(D)阴性血源库的建立与管理
人类Rh血型是红细胞血型中仅次于ABO血型的重要血型系统,Rh(D)阴性者约占我国总人口的0.3%～0.5%,属稀有血型[1].在临床输血中,Rh(D)抗原具有重要的临床意义,此类病人在创伤急救或手术用血时难以及时找到同型血源,因此临床Rh(D)阴性患者用血极其困难.
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邯郸住院患者ABO和Rh血型分布概况
ABO血型和Rh血型系统是红细胞的两大抗原抗体系统,Rh抗原中D的抗原性强,习惯上将有D抗原者称Rh阳性,无D抗原者为Rh阴性.两大系统在临床输血、血液遗传、器官移植和新生儿溶血病的诊断有重要意义.邯郸地处晋、冀、鲁3省交界处,我院是本地区大的医院,用血量在本地占有很大的比例,统计我院住院患者的ABO和Rh血型情况,为合理开发本市血液资源及疾病的研究有重要作用.
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北京地区Rh(D)阴性献血者分型及不规则抗体筛查
目的 研究北京地区Rh(D)阴性献血者Rh血型系统抗原分型及各型在ABO血型系统中的分布规律并进行不规则抗体的筛查、特异性鉴定.方法 U型板微量盐水法筛选Rh(D)阴性献血者、间接抗人球蛋白法试验和吸收放散试验进行确认,单克隆抗体血清试剂检测献血者红细胞Rh血型系统的C、c、E、e抗原,盐水法和间接抗人球蛋白试验筛查不规则抗体.结果 249份初筛为RhD阴性的献血者确认结果为弱D/部分D19例(7.6％)、DEL 26例(10.4％)、阴性204例(81.9％),筛查出不规则抗体3例(1.2％);204份阴性献血者中各血清学表型以ccee(63.7％)和Ccee(24.5％)为主.结论 对本地区Rh(D)阴性献血者血清学分型及不规则抗体进行调查,对建立Rh(D)阴性献血者资料库,提高输血安全有重要意义.
