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Stargardt病的分子遗传学研究进展
Stargardt病(STGD)是一组进行性眼底黄斑营养不良的遗传性疾病,多于青少年期发病,表现为进行性中心视力减退,黄斑与色素上皮萎缩,常伴随后极部斑点,尚无有效治疗方法.STGD多呈常染色体隐性遗传,少数为常染色体显性遗传或X-连锁隐性遗传.目前已发现4个染色体区段与本病相关,并因此将本病分为STGD1、STGD2、STGD3和STGD4.其中,STGD1与STGD3的致病基因已被克隆,已通过体外表达研究相关蛋白突变体的性质,对于致病基因的结构、突变功能、蛋白突变体及其发病机制的研究目前已有了新的进展.
关键词： Stargardt病 常染色体显性 常染色体隐性 突变 -
精子鞭毛缺陷导致弱精子症的研究进展
全世界目前约有8％～15％的夫妇婚后一年不育,其中男性因素导致的不育占到所有病例的50％.另外,弱精子症也是导致男性不育的一个重要因素,弱精子症的精子总数和浓度正常,但前向运动精子<32％或精子总活力<40％[1].
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超选择性肝动脉栓塞术治疗多囊性肝病初步研究
目的 探讨超选择性肝动脉栓塞术(TAE)治疗多囊性肝病(PLD)的安全性及临床疗效.方法 2011年10月至2013年10月,采用栓塞微粒球Embosphere(R)对14例有明显临床症状的PLD患者施行超选择性TAE术,其中女性11例,男性3例;年龄42～65岁,平均(48±5)岁.术前和术后每3个月行CT肝扫描,同时复查血常规、肝功能.结果 TAE技术成功率为100％.术后随访12～24个月,12例症状明显缓解,2例无效,有效率为85.7％.术后患者症状开始缓解时间平均为(3.2±1.1)个月.术后18个月时CT随访显示肝脏总体积、囊肿总体积较术前分别缩小(19.3±5.6)％、(20.4±7.8)％,差异有统计学意义(P＜0.05).术后患者转氨酶呈一过性升高,无严重并发症发生.结论 采用栓塞微粒球行超选择性TAE治疗PLD疗效可靠、安全性高,可作为传统治疗手段的补充,值得临床推广应用.
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常染色体显性遗传多囊肾差异表达基因的研究
目的:应用表达谱芯片研究常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)与正常肾组织基因表达的差异,探讨此病的致病因素及可能的治疗途径.方法:等量的人正常肾和ADPKD肾组织的mRNA分别用Cy3和Cy5逆转录荧光标记,制作cDNA探针,混合后与4 096点人cDNA表达谱芯片进行杂交,ScanArray4000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,数字化处理和分析后比较两种组织基因表达谱的差异.RT-PCR法验证其中4条基因表达水平.结果:在ADPKD肾组织与正常肾组织中存在463条差异表达基因,其中206条基因在多囊肾组织中高表达,特别是细胞周期素D2(cyclin D2)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)、成纤维细胞活化蛋白基因等;257条基因在多囊肾组织中低表达,特别是蛋白磷酸酶1A、酸性磷酸酶1基因等.RT-PCR法验证的4条基因表达水平与芯片结果相一致.结论: ADPKD病理改变可能与细胞周期蛋白、MMPs以及各种生长因子相关基因的上调有关,钙调素抑制剂和MMPs抑制剂可能会对其有一定的治疗作用.
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常染色体显性多囊肾病Han:SPRD大鼠肾脏病理观察及其意义
目的:观察常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)的Han:SPRD大鼠模型的肾脏病理变化,为揭示ADPKD发病机制提供证据与线索.方法:选取雄性2周龄Han:SPRD纯合大鼠(cy/cy)和3个月龄杂合大鼠(cy/+),取其肾组织进行H-E染色、PAS染色、Masson染色以及透射电镜观察.结果:光镜下发现Han:SPRD大鼠肾脏体积增大;囊肿衬里上皮细胞增殖显著;小管基膜增厚,可见灶性小管萎缩和较多蛋白管型;肾小球数目减少、体积缩小,渐趋废弃,呈明显缺血样改变,血管壁增厚.透射电镜可见肾小球毛细血管腔阻塞,基底膜薄厚不均,部分断裂;小管上皮细胞胞质脱落,微绒毛紊乱、部分缺如;细胞外间质成分稀少;囊肿衬里上皮细胞内可见大量线粒体,高尔基体、核糖体丰富.结论:Han:SPRD大鼠肾脏组织学和超微结构的改变可解释多囊肾病的部分临床表现;并观察到Han:SPRD大鼠肾小管上皮细胞微绒毛异常,为揭示疾病的发病机制提供了线索.
关键词： 多囊肾病 常染色体显性 动物模型 Han:SPRD大鼠 -
胰岛素样生长因子在常染色体显性遗传性多囊肾病发病中的作用
目的:研究胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowth factor-1,IGF-1)在常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomaldominant polycystic kidney disease,ADPKD)发病中的作用.方法:采用酶联免疫吸附法测定41例ADPKD患者血液、囊肿液及尿液中IGF-1浓度;应用免疫组织化学染色方法检测IGF-1及其受体(IGF-1R)在ADPKD囊肿组织中的表达.结果:41例ADPKD患者囊肿液中的IGF-1浓度(1 62.0±5.06)ng/ml显著高于血液(76.0±28.13)ng/ml和尿液(62.0±11.18)ng/ml中浓度(P＜0.01);IGF-1和IGF-1R在ADPKD囊肿组织中的囊肿衬里上皮细胞、平滑肌细胞及间质细胞均呈阳性表达.结论:囊肿液中IGF-1的增多可能来自囊肿衬里上皮细胞及间质细胞的合成和分泌,并与囊肿的形成和长大有关.
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长链PCR在中国汉族人多囊肾病1型致病基因突变检测中的应用
目的:研究特异性分离中国汉族人多囊肾病1型致病基因(polycystic kidney disease gene 1,PKD1)多拷贝区的方法,以排除同源序列对该基因突变检测的干扰.方法:利用与同源序列间的个别碱基差异设计8对能涵盖PKD1多拷贝区的长链PCR引物,分别对两例健康汉族人基因组DNA进行PCR,其扩增产物通过巢式PCR进行序列测定.结果:通过优化PCR体系,尤其是以高质量基因组DNA为模板,适当提高退火温度,经巢式PCR测序证实扩增产物序列与PKD1多拷贝区一致.结论:该研究采用的长链PCR体系可克服同源序列的影响,适用于中国汉族人PKD1多拷贝区的特异性扩增,为进一步通过单链构象多态性分析检测汉族人PKD1突变位点奠定基础.
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利用PCR-SSCP技术检测中国汉族人PKD2基因的突变
目的:检测中国汉族人Ⅱ型多囊肾病基因PKD2的突变.方法:筛选临床确诊的26个中国汉族家系中31例常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)患者,提取外周血白细胞DNA,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP),取异常条带标本进行核苷酸序列测定,判别PKD2外显子突变位置及类型.结果:以20例健康志愿者为对照,从31例患者中成功检测出2种突变.1种为无义突变,系PKD2外显子13的第2407位碱基由胞嘧啶置换为胸腺嘧啶,形成1个终止密码子;另1种为错义突变,系PKD2外显子4的第964位碱基由胞嘧啶置换为胸腺嘧啶,使编码氨基酸由精氨酸变为色氨酸.结论:本研究建立了PCR-SSCP直接检测我国汉族人PKD2突变方法,检测出2种基因突变,为今后开展ADPKD患者囊肿前诊断提供了实验基础.
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土鳖虫水煎剂对人多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖的影响
目的:观察中药土鳖虫对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖的影响.方法:以灌服中药土鳖虫水煎液的SD大鼠血清为含药血清,灌服等量生理盐水的SD大鼠血清为对照血清.将囊肿衬里上皮细胞培养于含有下述物质的RPMI 1640液中:(1)上皮生长因子(EGF)0、2.5、5、10、20 ng/ml;(2)含药血清1%、2.5%、5%,以等量对照血清为对照;(3)EGF 10 ng/ml分别加含药血清1%、2.5%、5%,并以等量EGF加对照血清作为对照.培养48 h后,以5-溴-2-脱氧尿核苷嘧啶(Brdu)掺入法检测细胞增殖.结果:EGF能显著地刺激囊肿衬里上皮细胞增殖,一定范围内呈剂量依赖性;与对照血清比较,土鳖虫含药血清能明显抑制经或未经EGF刺激的囊肿衬里上皮细胞增殖,并呈剂量依赖性.结论:中药土鳖虫可能通过对囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用而阻滞或延缓囊肿的发生与发展.
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肝细胞生长因子对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响
目的:研究重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响.方法:用3H-TdR掺入法测定不同浓度(0.5、1、2.5、5 ng/ml)rhHGF作用48 h以及适浓度的rhHGF分别作用24、48、72 h ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞的增殖情况;并分别用3H-脯氨酸掺入法和放免法测定适浓度rhHGF作用佳时间后ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞胶原及层粘连蛋白的合成情况.结果:rhHGF促进了ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及胶原和层粘连蛋白的合成,以1 ng/ml持续作用48 h为显著.结论:rhHGF对体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成有明显的促进作用.
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多囊蛋白-1胞内区cDNA的克隆与表达
目的：获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法：用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段，然后插入融合蛋白表达载体pProEX Hta 中，经测序证实后，转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果：克隆到一个660 bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段，得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论：多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。
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常染色体显性遗传多囊肾病囊肿去顶减压术价值的探讨
目的: 结合临床实际,从理论上分 析囊肿去顶减压（CD）术治疗常染色体显性遗传多囊肾病（APKD）的价值。方法: 收集本院1985至1995年间行CD术的39例APKD患者（31例单侧，8例双侧）,分析 其在术后3、6个月及1、3、5年等各时期，腰痛复发率、高血压加重率、囊肾增大率和肾功 能异常率等指标的变化情况，并分析其理论依据。结果:行单侧CD术的 31例，术后5个时间点各临床指标的变化情况：（1）囊肾增大率分别为19.4%、38.7%、61.3 %、100%和100%；（2）腰痛复发率分别为12.9％、48.4％、71.0％、100％和100％；（ 3）高血压加重率分别为6.5%、22.6%、41.9％、71.0％和96.8％；（4）肾功能异常率分别 为3.2%、12.9％、22.6％、74.2％和96.8％。结论:CD术在短期（1年 ）内，对解除APKD患者腰痛症状具有肯定的作用，但对高血压、囊肾增大和肾功能的改善情 况却不明确；就长期而言，其治疗作用难以肯定。
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Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病基因诊断与基因突变情况的调查
目的:(1) 建立Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKDⅠ)的基因诊断方法;(2) 寻找具有普遍意义的突变方式,以优化基因诊断.方法:(1) 采用Southern杂交和 PCR 方法, 调查ADPKDⅠ基因3'端单拷贝区突变情况;(2) PCR扩增分析微卫星SM7.结果:将AH4与16例患者的基因组DNA进行Southern杂交后, 均显示有正常的15 kb的杂交片段.对27例患者ADPKD Ⅰ基因3'端AH4和JH14两探针间的5.72kb 基因组DNA行PCR扩增后,未发现5.5kb基因组DNA缺失.109名正常人SM7 PCR扩增显示,其多态信息含量(PIC)值为0.76,3个家系的SM7 等位片段与疾病基因连锁关系明确.结论:在汉族中:(1) ADPKDⅠ基因3'端单拷贝区无常见性大片段基因组DNA缺失类突变;(2) SM7所含PIC 较高,用其可在70%～80%的ADPKDⅠ家系中作出基因诊断.
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洛伐他汀对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖和细胞外基质分泌的影响
目的:观察洛伐他汀对人常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖和细胞外基质(ECM)分泌的影响.方法:用不同浓度的洛伐他汀和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)处理培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞,24或48 h后,MTT法检测细胞增殖,ELISA法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型前胶原和Ⅳ型胶原.结果:ADPKD囊肿衬里上皮细胞分别经1,5,10,20,50 μmol/L洛伐他汀处理24或48 h后,细胞增殖、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原分泌受到明显抑制,呈剂量依赖性关系.GGPP能明显逆转洛伐他汀对ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖和ECM分泌的抑制作用.但洛伐他汀对Ⅲ型前胶原分泌无明显影响.结论:洛伐他汀可能通过阻断甲羟戊酸途径,抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖、Ⅰ型和Ⅳ型胶原等细胞外基质的表达,从而延缓多囊肾病的发生与发展.
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遗传标记RFLP、STR、SNP在常染色体显性遗传性多囊肾病基因连锁分析中的应用
常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性疾病,危害性很大,临床上可通过连锁分析早期发现,以隔断基因的遗传.而连锁分析需借助遗传标记进行研究,3代遗传标记RFLP、STR、SNP为ADPKD基因定位和疾病诊断提供了有力的工具,因此本文综述了RFLP、STR、SNP在此病连锁分析中的应用.
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上海市汉族人群与PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA的多态性分析
目的:研究与多囊肾病PKD1基因紧密连锁的4个微卫星DNA的多态性,为家系连锁分析和临床分子诊断提供有用的遗传标记.方法:抽提上海市80名汉族无关个体(均为健康志愿者)的DNA,对其进行4个微卫星位点(KG8、SM6、CW2和SM7)的PCR扩增,采用毛细管电泳法分离PCR扩增产物,用GeneScanTM、GenotyperTM软件对其进行基因分型.结果:在上海市汉族人群中,发现KG8、SM6、CW2、SM7分别有4、10、11和9个等位基因片段,其杂合度和多态信息含量分别为0.29和0.274、0.825和0.819、0.786和0.779、0.85和0.827,群体分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论:微卫星位点SM6、CW2、SM7具有较高的杂合度和多态信息含量,在基因连锁分析和群体遗传学中具有较重要的应用价值.
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常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿液对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的:观察常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)囊肿液对肾小管细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响,以初步探讨ADPKD囊肿发生、发展的机制.方法:用不同浓度的ADPKD囊肿液处理MDCK和LLC-PK1两株肾小管细胞,采用MTT法观察细胞增殖,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡指数.结果:(1)与对照组相比,不同浓度(10%、20%、40%、60%,V/V)ADPKD囊肿液作用24 h能明显促进上述两株肾小管细胞增殖,并呈剂量依赖性;而且明显影响细胞周期,使G0～G1期细胞增多、S期细胞减少.(2)高浓度(40%、60%)ADPKD囊肿液作用48 h对MDCK细胞仍有上述作用,但对LLC-PK1细胞则无类似作用.(3)不同浓度ADPKD囊肿液均不诱导上述两株细胞凋亡.结论:ADPKD囊肿液可剂量依赖性地促进肾小管细胞增殖,并在24 h达作用高峰,但并不诱导肾小管细胞凋亡,其机制可能与囊肿液通过激活G1期细胞,使细胞未从G1期脱离细胞周期而发生凋亡有关.
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角质细胞生长因子在常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿组织中的表达定位
目的:在蛋白水平研究角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)在常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomel dominant polycystic kidney disease,ADPKD)囊肿组织中的表达及定位.方法:分别采用蛋白质印迹及免疫组化方法分析ADPKD患者囊肿组织中KGF的表达和进行细胞定位.结果:与正常肾组织相比,ADPKD患者的囊肿组织KGF含量明显增高,约是前者的4倍,主要在囊肿衬里上皮细胞和残存的正常肾小管上皮细胞中表达.结论:KGF在ADPKD囊肿组织局部的过度表达可能是ADPKD囊肿形成和发展的重要因素之一.
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4-羟苯基维甲酸诱导常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿衬里上皮细胞凋亡
目的:探讨4-羟苯基维甲酸(4-HPR)诱导常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞凋亡的作用及其机制.方法:采用MTT法检测1、2.5、5、10 μmol/L 4-HPR分别作用ADPKD囊肿衬里上皮细胞24、48、72、96 h后细胞的增殖情况;采用锥虫蓝染色、DNA电泳、Hoechst 33342染色检测4-HPR作用后的肝细胞生长因子(HGF)刺激的ADPKD囊肿衬里上皮细胞的存活率和凋亡率;采用免疫组化及半定量分析检测4-HPR对HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞表达HGF和c-Myc蛋白的作用.结果:与对照组比较,4-HPR抑制了ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖,且呈量效和时效关系,5 μmol/L 或 10 μmol/L 4-HPR作用96 h后抑制效果强(P<0.01).4-HPR显著降低HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞的存活率,且诱导细胞凋亡,与对照组比较差异显著(P<0.01).与HGF组比较,4-HPR显著降低HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞表达HGF蛋白(P<0.01),但不影响表达c-Myc蛋白.结论:4-HPR诱导了HGF刺激的ADPKD囊肿衬里上皮细胞凋亡,其机制可能通过降低HGF刺激的ADPKD囊肿衬里上皮细胞表达HGF蛋白,不是影响c-Myc蛋白的表达.
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肝细胞生长因子对ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成细胞外基质、基质金属蛋白酶及其抑制剂的作用
目的:观察重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞合成细胞外基质(ECM)、基质金属蛋白酶及其抑制剂的作用.方法:采用放免法测定细胞合成层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PⅢNP),采用ELISA法检测细胞合成Ⅳ型胶原(ColⅣ);采用RT-PCR方法测定细胞表达转化生长因子β1(TGFβ1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2) mRNA的情况;用蛋白质印迹方法检测细胞上清液中MMP-2蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-2活性.结果:rhHGF及rhHGF+抗TGFβ1抗体组ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成LN、ColⅣ显著增多,但两组比较无显著差异.对照组、rhHGF组、 rhHGF+抗HGF抗体组及rhHGF+抗TGFβ1抗体组各组间合成PⅢNP值均无显著差异.对照组、rhHGF组、 rhHGF+抗HGF抗体组各组比较TGFβ1 mRNA表达无显著差异.与对照组比较,rhHGF显著上调细胞MMP-2 mRNA和细胞上清液中MMP-2蛋白表达及MMP-2活性,显著下调细胞TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达.结论:HGF促进ADPKD囊肿衬里上皮细胞合成LN和ColⅣ,增加MMP-2表达,抑制TIMP-1、TIMP-2的表达.这些改变可能参与了ADPKD囊肿的发生及发展.
