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潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建
目的配合HBV载体的研究,为HBV载体提供包装.方法HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到潮霉素抗性pMEP4载体,转染HepG2细胞系,用潮霉素筛选形成细胞克隆.检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒,PCR方法观察上清液中病毒的形成.结果包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg;携带重组HBV的G418抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后,经两种抗生素同时筛选,在细胞培养上清液中能检出突变型HBV,未检出野生型HBV.结论删除了包装信号的HBV次全基因,失去了形成完整HBV颗粒的能力,但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白.
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利用CRISPR／Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株
目的：利用CRISPR／Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据GenBank中RNase L基因序列，设计RNase L敲除的小指导RNA（ sgRNA）序列，将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中，获得pCas指导RNA（ gRNA）载体；设计供体DNA的同源臂序列，通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板，并将其克隆到pBackZero-T表达载体上，获得pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞，用潮霉素B筛选，通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体pCas-gRNA和pBackZero-T-RNase LK，Western印迹和DNA测序结果表明，成功获得5株RNase L缺失的细胞株，为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。
