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菌体内可溶性表达重组THANK蛋白的免疫调节活性分析
目的构建含有人THANK基因的表达载体,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达,并对表达的THANK蛋白的免疫调节活性进行检测.方法从含有全长THANK cDNA的pMD18-THANK质粒中克隆THANK的胞外区片段,并将其亚克隆至原核表达载体pET-11a中,筛选阳性重组质粒pET-THANK,以IPTG诱导其可溶性表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测进行分析.表达的蛋白初步纯化后,分析其对B、T细胞的免疫调节活性.结果PCR扩增出了THANK胞外区cDNA片段.SDS-PAGE和Western分析证实重组的pET-THANK质粒可表达出THANK蛋白.可溶性THANK重组蛋白可共刺激B、T细胞的增生,并可诱导活化T细胞的凋亡.结论本实验成功地将THANK胞外区片段在大肠杆菌中进行表达,表达的蛋白具有免疫调节活性.
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THANK作用下T淋巴细胞的功能及表型分析
目的观察THANK对T淋巴细胞的免疫调节功能.方法在克隆和表达THANK基因的基础上,将THANK蛋白作用于B、T淋巴细胞,用3H-TdR掺入法检测其对B、T淋巴细胞的共刺激作用,并用流式细胞仪观察THANK对T细胞的功能调节.结果 THANK除可共刺激B细胞的生长外;还可增强抗CD3单抗所引起的T细胞增殖,使外周成熟T细胞向效应功能转化,并可诱导活化后的T细胞,尤其是CD4+T细胞,凋亡及其表型变化.结论 THANK可调节T细胞表型及功能变化.
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THANK基因的克隆和序列分析
目的 克隆THANK基因全长及胞外区片段并测序。方法采用RT-PCR技术，从人白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD-18 T载体，转染大肠杆菌、抽提质粒后，用ABI PRISMTM377XL DNA自动测序仪测序。结果 RT-PCR扩增出一个858 bp的DNA片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该858 bp片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。结论 本实验成功地克隆了人THANK基因，为进一步表达人THANK基因并研究其功能，开发与临床应用奠定了基础。
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人THANK基因真核表达载体的构建及其在人胚肾细胞中的表达
THANK(TNF homologue that activates apoptosis, NF-κB and JNK)[1]是1999年发现的肿瘤坏死因子超家族中的第13个成员,TNFSF13B,又称为BAFF[2,3](B cell activating factor belonging to the TNF family)、TALL-1[4]( TNF- and APOL-related leukocyte expressed ligand 1)和Blys[5]( B lymphocytestimulator).THANK具有TNF的全部活性,能抑制多种肿瘤细胞的生长,引起细胞凋亡;用其蛋白作用于人白血病U937 细胞能激活NF-κB及JNK的表达[1];且可共刺激B细胞的生长,如转入THANK基因的小鼠,可显著增加其体内成熟B细胞、脾脏和淋巴结中CD4+和CD8+效应T细胞的数量,并诱导免疫球蛋白分泌[3,6].近的研究发现,THANK通过其两个受体-TACI ( transmembrane activator 和 CAML- interactor)与BCMA( B cell maturation antigen)对体液免疫起重要的调节作用[7 11] ,而其对细胞免疫的调节还在深入的研究中.为探讨THANK的功能,我们在THANK基因克隆的基础上,构建了THANK基因真核表达载体,建立了稳定表达THANK蛋白的细胞株,并检测了表达蛋白的活性.
关键词： 人THANK基因 RT-PCR Western blot 真核表达
