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c-di-GMP通过趋化调节蛋白CheB/CheR调控钩端螺旋体运动
目的 问号钩端螺旋体(简称钩体)是引起钩体病的重要病原体,人类通过带菌动物尿液污染的疫水或疫土而感染,趋化和运动系统在钩体感染过程中发挥重要作用.钩体基因组序列分析表明其中有数个趋化调节蛋白CheB和CheR的编码基因,但其具体的调控机制未知.方法Real-time PCR检测了钩体基因组中5个基因在钩体感染宿主细胞过程中mRNA的水平变化;T-A克隆了CheB和CheR的编码基因片段并构建了原核表达系统;检测了c-di-GMP浓度变化对CheB和CheR表达菌株表型的影响.结果 在感染细胞60 min后,cheB1的mRNA水平显著提高,cheB3也有一定程度的提高,而cheB2和cheR则无明显差异;成功构建了5个基因的原核表达系统,其中重组CheB1、CheB3和CheR2蛋白使大肠杆菌运动能力明显增强;在加入二鸟苷酸环化酶抑制剂和磷酸二酯酶抑制剂后,各表达菌株形成菌落大小与对照相比无明显不同,但CheB2菌落形态与对照相比出现明显褶皱.结论 CheB和CheR可影响大肠杆菌的swarming运动能力,并受胞内c-di-GMP浓度的影响.
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细菌HD-GYP结构域蛋白研究进展
环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的第二信使分子,参与调节细菌的运动、黏附、毒力及生物膜形成等多种生理活动.c-di-GMP在胞内的代谢主要由含有GGDEF结构域的二鸟苷环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)调控.其中HD-GYP结构域蛋白是近几年新发现的参与调控c-di-GMP的磷酸二酯酶,本文从HD-GYP结构域蛋白的结构、作用特点和生物学功能等方面进行综述.
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环二鸟苷酸(c-di-GMP)在微生物体内的作用及其类似物的研究
环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是在细菌中普遍存在的第二信使分子,参与调节多种生理功能,包括细胞分化、生物被膜形成、致病因子产生等.细菌细胞内c-di-GMP合成与降解代谢分别受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)调控,DGC和PDE共处于同一个蛋白中,是一个双功能蛋白酶的两个区域,分别负责菌体内c-di-GMP的合成和降解.c-di-GMP作用菌体内下游靶点包括PilZ结构域和GEMM核开关两种类型.目前发现c-di-GMP核开关是唯一不参与代谢活动而参与信号传导的一类核开关.本文综述了c-di-GMP的代谢途径、调控机制、生物学功能,以及c-di-GMP结构类似物合成及生物学评价等方面的新研究进展.
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环二鸟苷酸对铜绿假单胞菌生物被膜的调控研究
环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是细菌中存在的众多信使分子之一，参与调节多种生理功能，包括细菌的信号传递、内外环境调理、生物被膜形成等。考虑其对细菌抗生素耐药的物理屏障———生物被膜（biofilm，BF）形成的影响，c-di-GMP的研究越来越受到人们的关注。由磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）降解和二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase，DGC）的合成两条途径对细菌内c-di-GMP进行调控， PDE和DGC共处于同一个蛋白中，是一个双功能蛋白酶的两个区域。本文通过综述c-di-GMP的代谢途径、生物学功能以及对铜绿假单胞菌生物被膜调控研究的新结果，对c-di-GMP在今后研究中的应用和发展趋势进行展望。
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环二鸟苷酸对M1型巨噬细胞极化及促炎作用的体外研究
目的:探讨牙龈卟啉单胞菌毒力因子环二鸟苷酸(c-di-GMP)对M1型巨噬细胞极化的调控作用及其体外促炎作用.方法:使用不同质量浓度(0.25、1、4、16、64μg/mL)的c-di-GMP分别处理RAW 264.7细胞3、6、12、24 h,采用实时定量RT-PCR、ELISA及流式细胞术检测炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6以及巨噬细胞M1型极化标志细胞因子IL-23和M2型极化标志细胞因子IL-10的mRNA、蛋白质和细胞表面标志物的表达.结果:RAW 264.7细胞TNF-α、IL-6和IL-23的mRNA表达水平随c-di-GMP的浓度和时间的变化均有不同程度的增高,具有剂量和时间依赖性,而IL-10的表达水平在各组中无显著升高;ELISA结果与实时定量RT-PCR结果基本相同;流式细胞术结果显示在c-di-GMP刺激RAW 264.7细胞24 h后,细胞表面分子F4/80与CD86双阳性率、CD86单阳性率明显增高.结论:c-di-GMP能够刺激M1型巨噬细胞相关细胞因子IL-23及炎症因子TNF-α和IL-6的表达,诱导巨噬细胞发生M1型巨噬细胞极化,进而导致炎症反应,提示c-di-GMP可能通过诱导巨噬细胞发生M1型极化,进而在牙周炎的发生、发展过程中发挥重要作用.
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问号钩端螺旋体GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白生物信息学分析
目的 分析问号钩端螺旋体(钩体)环二鸟苷酸(Cyclic dimeric-GMP,c-di GMP)调节相关的GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白生物信息学结果,为后续的功能研究奠定基础.方法 PSI BLAST方法分析编码GGDEF和EAL/HD-GYP结构域蛋白的基因;利用相应生物信息学软件对蛋白信号肽序列、跨膜序列、蛋白结构、同源性进行分析并构建目的蛋白进化树.结果 问号钩体中22个蛋白分别含有GGDEF或EAL/HD-GYP结构域,多数蛋白均有感受器结构域和跨膜区.7个具有PAS输入感受器的GGDEF结构域蛋白进化较为独立,位于单独的一个分支,其余6个GGDEF结构域蛋白则分散在不同的分支上.4个EAL结构域蛋白和2个HD-GYP结构域蛋白进化上也较为独立,分别处于同一进化分支.3个GGDEF和EAL结构域耦合的蛋白在进化关系上更趋向于PDE活性蛋白.结论 钩体具有多拷贝的合成和降解c-di-GMP相关蛋白编码基因,表明在钩体中c-di-GMP网络具有高度复杂性,同时反映出钩体对环境条件的改变具有复杂的应对机制.
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环二鸟苷酸调控细菌生物膜形成的研究进展
生物膜(BF)是细菌附着到接触物表面形成的多细胞群体,生物膜的形成不仅有利于细菌的生存,同时也增强了感染性.环二鸟苷酸(C-di-GMP)是群体感应系统中的一种重要的胞内信号分子.包含GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGCs)可将两分子的GTP合成C-di-GMP,并在含有EAL和HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDEs)作用下水解.C-di-GMP的水平在这两种酶调节下发生改变,通过影响下游受体调控细菌的毒性、运动性、纤维素合成、黏附性、生物膜形成等多种功能.本文就细菌生物膜形成和C-di-GMP的调节作用的研究进展做一综述.
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嗜酸乳杆菌GGDEF和EAL结构域相关蛋白的表达、纯化及活性分析
目的 鉴定嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能.为进一步研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)在该菌株中的调控机制奠定基础.方法 从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH 13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13 07055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒.经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物.结果 通过PCR扩增的目的基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果与GenBank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功.SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000(含GGDEF结构域)、67000(含EAL结构域)和72000(含EAL结构域),与预期大小吻合.经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的蛋白.高效液相色谱分析结果显示,NH13_07045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶(DGC)活性,NH1307050的表达产物体外具有磷酸二酯酶(PDE)活性,而NH13 07055的表达产物在体外无明显PDE活性.结论 在本研究的3种基因中,NH13_07050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶(PDE)的活性.为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据.
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环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性研究
目的:通过构建环二鸟苷酸降解酶磷脂酶D基因突变株,探讨环二鸟苷酸与铜绿假单胞菌形成生物膜的相关性.方法:采用基因工程技术构建磷脂酶D基因突变质粒,通过同源重组转化至野生型铜绿假单胞菌PA01,抗性筛选获得基因突变株bf-.扫描电子显微镜下观察基因突变株与野生菌株生物膜表型的差异.结果:与野生菌株相比,基因突变株bf-细菌微克隆的形成增加,有利于细菌在导管材料表面形成生物膜.结论:环二鸟苷酸的增加可促进细菌生物膜的形成,与铜绿假单胞菌引起的院内感染和耐药性密切相关.
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新型免疫佐剂环二鸟苷酸的制备与纯化
目的 制备新型免疫佐剂环二鸟苷酸(c-di-GMP)并进行纯化.方法 利用前期重组构建并在大肠杆菌中成功表达的霍乱弧菌VCA0956蛋白(含有GGDEF结构域)作为合成酶,在反应体系中采用酶促反应将2分子鸟苷酸GTP催化缩合成一分子c-di-GMP.利用反相液相色谱仪分离纯化粗产物中的c-di-GMP,柱温25℃,流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(体积比为5:95逐渐变为30:70),流速1mL/min.结果 c-di-GMP从反应粗产物中被有效的分离纯化,同时,经质谱分析仪分析鉴定,获得高纯度的c-di-GMP.结论 成功从酶促反应体系中分离并纯化了c-di-GMP.
