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黑曲霉菌pyrG基因的克隆与黑曲霉菌同源转化系统的建立
黑曲霉菌(Aspergillus niger)是一种不产生黄曲霉毒素的丝状真菌,它有生长迅速、易于培养、可大量产生分泌性蛋白质的特点,因此它除了在生产各种真菌代谢物及酶类的发酵工业上被广泛应用外,在基因工程中作为宿主菌生产蛋白质产物方面也受到很大重视和应用。为了将待表达的基因导入宿主菌,首先需要建立一个稳定有效的基因转化系统。以乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(pyrG)基因作为标志基因并以该基因的缺陷株真菌作为受体菌的转化系统已被证明是一种十分行之有效的基因转化系统。乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶是尿嘧啶核苷酸合成中一种关键性酶,缺乏该酶的pyrG缺陷株不能在不含尿嘧啶核苷的培养基上生长。通过基因转化,向其导入含pyrG基因的质粒,可使其获得在不含尿嘧啶核苷培养基上生长的能力。如果将要导入的基因连接在该质粒上,此时pyrG可作为基因是否导入的标志。我们首次从黑曲霉菌ATCC 12049野生型菌株的基因文库中克隆获得全长pyrG基因,并在此基础上构建了表达性质粒载体,建立了pyrG基因为标志基因,以同型黑曲霉菌pyrG基因缺陷株为受体菌的同源基因转化系统。
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外源性p53基因对人卵巢癌细胞的生物学行为及化疗放疗敏感性的影响
p53基因是至今发现与人类恶性肿瘤相关性高的基因, 约50%的人类恶性肿瘤中存在p53基因的异常[1].近年还发现p53功能异常与肿瘤对化疗、放疗的不敏感有关[2,3].因此在基因治疗的研究中p53基因的地位十分突出.卵巢肿瘤是妇科常见的恶性肿瘤,难于早期诊断,死亡率高.已发现45%~80%的卵巢肿瘤伴有p53基因的异常[4,5].因此我们构建了人野生型p53基因的真核细胞表达载体并转染人卵巢癌SKOV-3细胞,观察其对卵巢癌细胞的生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响.1 资料与方法1.1 一般资料1.1.1 酶及主要试剂限制性内切酶及T4连接酶购于美国Promega公司.G418(geneticin)及脂质体(lipofectin)购于美国GIBCO公司.p53单克隆抗体(DO-1)及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购于北京中山生物技术公司.1.1.2 基因、载体和受体菌质粒pGEX-p53含有人野生型p53cDNA由起始至终止密码的序列.真核表达载体pcDNA3为本室所有,受体菌为DH5α.