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小鼠胃幽门部类器官长时期培养模型的建立和形态分析
目的 探讨建立基于干细胞的小鼠胃幽门部类器官体外长期培养体系的方法,分析实验操作中的注意事项,为促进胃发育、生理、感染和肿瘤发生等研究提供理想的实验模型.方法 培养和收集R-Spondin1、Wnt-3A条件培养基,按生长因子比例制备类器官培养基.处死C57BL/6小鼠,分离胃幽门部,彻底清洗、消化并收集胃腺体.基质胶包埋后加入类器官培养基,显微镜下观察类器官生长状况.收集生长时间为1个月和5个月的类器官,制成石蜡标本,行HE和Ki67免疫组织化学染色,比较两个时间点的类器官形态和增殖能力.结果 在基质胶和类器官培养基的作用下,胃幽门部类器官能长期持续培养达7个月以上.组织形态上,生长时间为1个月和5个月的类器官均显示由单层柱状上皮构成.Ki67阳性细胞数前者稍高,但后者仍具一定的生长增殖能力.结论 成功建立了小鼠胃幽门部类器官体外长期培养体系,建立了类器官的石蜡样本处理方法并优化步骤,提供了具广泛应用前景的新兴的实验模型.
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三维立体培养间充质干细胞的生物学特性
目的 比较三维立体培养(3D)的间充质干细胞与传统贴壁培养(2D)的间充质干细胞在生物学特性上的差异,探索前者在细胞移植治疗中应用的可能性.方法 分离人胎盘来源的间充质干细胞,分别运用传统贴壁和改良的三维立体方法培养间充质细胞;在普通光学显微镜下,观察两种不同培养方式下的细胞变化,同时运用流式细胞仪检测二者凋亡情况以及细胞直径,应用RT-PCR和ELISA的方法分别从mRNA和蛋白质水平检测其分泌营养因子和抗炎因子的能力.结果 3D间充质干细胞大小均一,成球形聚集生长;流式细胞术测定两组细胞的凋亡情况,结果显示在细胞凋亡方面,两种培养方式无统计学差异(91.6％ vs 96.0％,P=0.234);3D间充质干细胞的直径明显小于2D间充质干细胞(10.15 μm vs 16.31 μm,P＜ 0.001),降低了37.8％,差异有统计学意义;RT-PCR结果示3D间充质干细胞的分泌营养因子(VEGF,NT-3)和抗炎因子(IL-4,IL-10,IL-11,IL-13)能力明显增强(P均＜0.05);ELISA结果示3D间充质干细胞在VEGF的表达上明显强于2D间充质干细胞(222.50±1.23 pg/ml vs 118.07±6.75 pg/ml;P=0.002).结论 相比于2D间充质干细胞,3D间充质干细胞在多个方面表现出明显优势,可作为将来细胞移植治疗临床试验的种子细胞.
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细胞因子对肺癌H460细胞MMP表达的影响及地塞米松的干预作用
目的 在肺癌H460细胞的三维立体培养过程中,直接观察细胞因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β]对肺癌H460细胞关于基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9表达的诱导作用及地塞米松的干预作用.方法 在肺癌H460细胞三维立体培养过程中加入细胞因子TNF-α和IL-1β来诱导MMP的表达,同时加入地塞米松干预MMP-2和MMP-9的表达;用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9,同时在培养5d后测定胶原含量大小.结果 TNF-α和IL-1β诱导培养在立体胶原内的肺癌H460细胞产生大量MMP-2和MMP-9,并促进其活化,引起大量胶原降解,地塞米松抑制了MMP-2及MMP-9的表达及活化,进而抑制了胶原的降解,对抗了细胞因子TNF-α和IL-1β对胶原的降解作用.结论 细胞因子TNF-α和IL-1β可诱导MMP的表达,MMP可直接降解肺内胶原,进而促进肺癌的侵袭或转移;地塞米松通过抑制MMP的表达与活化对抗MMP对肺组织的破坏作用,进而抑制了肺癌的侵袭与转移.
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全反式维甲酸与弹性蛋白酶对肺组织破坏的干预作用
目的 采用胚肺成纤维细胞三维立体培养技术,直接观察全反式维甲酸(RA)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对肺的主要成分之一胶原组织降解的干预作用.方法 在胚肺成纤维细胞三维立体培养过程中加入细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)]来诱导基质金属蛋白酶(MMPs)的表达,同时加入RA或NE干预MMPs及其组织抑制因子(TIMPs)的表达;用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9,用Western blotting法测定MMP-1、MMP-3及TIMP-1、TIMP-2,同时在培养5 d后测定胶原的含量及面积大小.结果 TNF-α和IL-1β诱导在立体胶原内培养的胚肺成纤维细胞产生MMP-1、MMP-3和MMP-9,但是只引起少量胶原降解(P＞0.05),同时加入NE,结果导致胶原几乎完全降解(P＜0.01).NE使MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9由非活化的形式转化为分子量较小的活化形式,同时,清除TIMP-1和TIMP-2.RA抑制了MMP-1的表达及MMP-3、MMP-9的活化,并削弱了NE对TIMP-1、TIMP-2的清除作用,进而抑制了胶原的降解.胶原降解后基质发生强烈收缩.结论 MMPs可直接降解肺内胶原和其他间质组织,导致肺组织破坏;NE通过活化MMPs引起或加速细胞外基质的破坏;MMPs与NE的协同作用可能是肺气肿等肺组织破坏的机制.RA通过抑制MMPs的表达与活化对抗NE对肺组织的破坏作用.
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多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体条件下生物学特性的影响
背景:多聚赖氨酸可促进软骨细胞、表皮细胞的黏附、生长及增殖.目的:观察多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体培养下生物学活性的影响.方法:采用流式细胞仪检测昆明小鼠脂肪来源干细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达,将脂肪来源干细胞分别与经多聚赖氨酸表面修饰的珊瑚羟基磷灰石或空白珊瑚羟基磷灰石体外复合培养.结果与结论:与空白珊瑚羟基磷灰石组比较,经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞较空白珊瑚羟基磷灰石组多,并分泌较多细胞基质,复合培养2,4,8 d的A值较明显增高(P < 0.05);但经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性值升高不明显(P > 0.05).说明多聚赖氨酸能促进脂肪来源干细胞在珊瑚羟基磷灰石表面的黏附、生长和增殖,不影响脂肪来源干细胞向成骨细胞转化.
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异体脱矿松质骨基质和纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程中的可行性探讨
目的进行人牙周膜细胞(PDLCs)三维立体培养的体外实验研究,初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性,为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础.方法组织块法培养人PDLCs,传代扩增后,接种于脱矿松质骨基质(CBM)和纳米羟基磷灰石材料(nHAC)两种三维支架上,体外继续培养3d,进行细胞计数和扫描电镜观察.结果人PDLCs在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构,细胞在支架材料上生长旺盛,伸展充分.结论CBM和nHAC均有望成为牙周组织工程的支架材料.
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H460小型细胞团在天然活性Ⅰ型胶原中三维立体培养模型的构建
目的:建立H460小型细胞团在天然活性Ⅰ型胶原中的三维立体培养技术.方法:实验于2006-07/11在解放军兰州军区兰州总医院呼吸内科实验室(博士后工作站)完成.①实验材料:H460细胞系由解放军总医院惠赠;Wistar大鼠,体质量150～200 g,实验中的胶原仅从大鼠的尾部肌腱提取,该大鼠来源为其他科室实验过程中未做任何处理的大鼠.②实验方法:将H460小型细胞团悬液、鼠尾提取的天然胶原(4 g/L)与4倍体积的DMEM共同混合为细胞浓度2x108 L-1、胶原浓度为1 g/L、1倍体积DMEM浓度.③实验评估:倒置显微镜观察细胞团在天然胶原中的生长状态,并与平面培养细胞相比较.结果:平面培养的细胞,其细胞团生长呈分散平铺的方式,单个细胞为不规则多边行,细胞之间有明显的间隙存在,而立体培养的细胞呈团块状,周围可见放射状毛刺突起,无法观察单个细胞.结论:H460小型细胞团在天然胶原中的三维立体培养为体外研究细胞生长及肿瘤细胞生长方式提供了一个更为类似体内环境的模型.
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体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化
背景:脂肪干细胞作为组织工程中种子细胞的选择,可以诱导为内皮细胞从而有效解决材料血管化困难的难题.目的:体外观察脂肪干细胞经诱导向内皮细胞转分化的可能性、以及在立体培养基上的血管形成情况.方法:切取人皮下脂肪,用酶消化法分离和培养脂肪干细胞,将传至第3代或第4代的脂肪干细胞用内皮细胞诱导液、同时在Matrigel三维培养基内诱导培养,观察细胞生长情况及变化.对脂肪干细胞和诱导细胞行免疫组织化学检查CD31的表达.结果与结论:免疫组织化学检测脂肪干细胞的CD31表达阴性,诱导细胞CD31可见阳性表达.在三维立体培养基内诱导的细胞24 h逐渐迁徙成团,伸出伪足,诱导1周细胞形成网格样交叉,2周形成较长血管,后血管增粗,并出现分叉,CD31阳性表达.因此,脂肪干细胞体外可以被诱导向内皮细胞表型转分化,并形成血管,提示脂肪干细胞可以作为促进组织工程移植物血管化的种子细胞的理想选择.
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胚胎肝细胞用于肝组织工程的体外培养研究
目的:观察三维受控组装系统下,胚胎肝细胞在三维立体结构的体外生长状态,探讨胚胎肝细胞在肝组织工程中应用的可行性.方法:用清华大学机械工程系研制的”三维受控组装系统”,将第15d小鼠胚胎肝细胞作为肝组织工程的种子细胞,与以明胶为主的复合材料混合,构建成复杂三维立体结构,观察其体外生长发育状态.对体外培养1周及4周的三维类肝组织标本进行苏木精-伊红(HE)染色,免疫组织化学方法检测甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)的表达,并对体外培养4周的三维类肝组织用PAS显色法检测肝糖原表达.结果:HE染色结果显示体外培养的胚胎肝细胞在三维支架材料中,可形成含有类血管和肝组织样结构;体外培养1周的类肝组织AFP表达呈阳性,体外培养4周的三维类肝组织ALB表达呈阳性,PAS显色亦呈阳性.结论:在三维受控组装系统的构建下,呈立体状生长的胚胎肝细胞,可逐渐形成肝组织样结构,并显示一定的肝脏功能.
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模拟微重力条件HN13细胞的生长特点
目的:观察口腔鳞状细胞癌细胞HN13在模拟微重力条件下的形态学特点和生长情况,检测肿瘤细胞分化和侵袭相关基因的表达,并分析其生物学意义.方法:将HN13细胞接种于聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA),应用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)进行模拟微重力培养14d,光学倒置显微镜下观察细胞的形态,以实时定量PCR检测分析立体培养和平面培养细胞中,HIF1α、TGFβ1、VEGF-C、NF-κB和CCND1等基因的表达.采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞贴附于PLGA材料表面呈立体生长,表现为典型角化细胞形态,并形成类角化珠样结构,与口腔鳞状细胞癌细胞形态相似.HIF1α,TGFβ1和NF-κB表达降低(P＜0.05),VEGF-C表达升高(P＜0.05),CCND1表达无显著改变(P＞0.05).结论:模拟微重力条件下三维培养的细胞更接近体内细胞的真实形态,模拟微重力可作为构建体外细胞三维培养模型的方法.
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间歇性红外线加热对人成纤维细胞三维立体培养的影响
目的观察红外线加热对人成纤维细胞三维立体培养的影响. 方法在人成纤维三维立体培养模型基础上,用红外线加热装置间歇性加热,共设42℃组(A组)、38℃组(B组)和33℃组对照组(C组),观察第0、2、3、5和7 d凝胶收缩状况及纤维细胞计数. 结果第3天,A组的胶原凝胶收缩(54.7%)明显大于B组(48.5%)和C组(34.8%)(P<0.001).第7天,A、B、C三组的胶原凝胶收缩分别为67%、55.8%和49.47%(P<0.001),同时发现,各组间成纤维细胞生长状况与胶原凝胶收缩呈正相关关系. 结论间歇性红外线加热可通过促进成纤维细胞增殖而使胶原凝胶收缩,对慢性伤口的愈合可能有促进作用.
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骨骼肌来源和骨骼肌筋膜来源的间充质干细胞成软骨差异的研究
目的 观察骨骼肌来源和骨骼肌筋膜来源的间充质干细胞成软骨能力的差异,以期找到合适的种子细胞达到抑制甚至逆转骨性关节炎软骨细胞退变.方法 取膝关节置换的患者的髌下骨骼肌组织及骨骼肌筋膜组织,酶消化法原代培养至第3代.波形蛋白(Vimentin)免疫荧光鉴定两种细胞,然后两种细胞进行三维立体培养(3D培养)来模拟体内细胞的生长环境并石蜡切片,阿尔新蓝(Alcian blue)染色研究两种细胞的成软骨能力差异.同时通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测成软骨及成骨标志物的基因表达量差异.结果 骨骼肌干细胞和骨骼肌筋膜干细胞爬片Vimentin免疫荧光结果,可以看到骨骼肌干细胞Vimentin免疫荧光的信号很弱,而骨骼肌筋膜干细胞的Vimentin免疫荧光呈阳性表现;两种细胞培养第14及第21天在3D培养条件下Alcian blue染色的情况是染色均有加深,但骨骼肌筋膜干细胞更加明显;骨骼肌筋膜干细胞的成软骨标志物性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)表达量明显高于骨骼肌干细胞.结论 骨骼肌筋膜来源间充质干细胞属于成纤维类细胞,而骨骼肌来源间充质干细胞属于成肌细胞.骨骼肌筋膜来源间充质干细胞成软骨能力较骨骼肌来源间充质干细胞更强,相反骨骼肌来源间充质干细胞的成骨能力更强.
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肿瘤和间质细胞相互作用对肺癌MMP-2和MMP-9表达的影响
目的 研究三维立体培养中肺癌H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞相互作用对MMP-2、MMP-9表达的影响.方法 活性胶原三维立体培养分为:H460细胞和胚肺成纤维细胞共同培养组;H460细胞和单核细胞共同培养组;胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养组;H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养组4组.明胶酶谱法测定各组培养基中MMP-2、MMP-9活性.结果 H460细胞和胚肺成纤维细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养时MMP-2酶原和活化酶活性和表达均增强,H460细胞和单核细胞共同培养时MMP-2酶原和MMP-9活性和表达增强,H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞共同培养MMP-2活化酶和MMP-9活性和表达明显增强.结论 肺癌H460细胞、胚肺成纤维细胞和单核细胞相互作用能通过上调MMP-2、MMP-9的表达促进肺癌的侵袭和转移.
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大鼠颅骨成骨细胞的胶原水凝胶三维立体培养
目的 建立大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(ROBs)的胶原水凝胶三维立体培养模型.方法 取新生SD大鼠颅骨,通过酶消化法获得成骨细胞.将传代培养的第一代(标记为P1代)ROBs与不同浓度Ⅰ型鼠尾胶原(胶原浓度为1、2、3 mg/mL)、DMEM培养液、NaOH等混合,调节混合液pH并将其置于37℃使胶原凝固成形,建立细胞的三维立体培养.ROBs立体培养3d后,普通显微镜观察细胞形态及密度,培养6d后二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)染色法鉴定细胞存活率;培养3 d、6 d、9 d后CCK-8检测法测定细胞活性,筛选出三维立体培养佳胶原浓度及佳培养体系.扫描电镜和HE染色观察佳培养体系中ROBs细胞形态以及细胞与胶原复合物的黏附和分布情况.结果 胶原浓度为2 mg/mL培养体系,胶原成形好、硬度高.ROBs三维立体培养3d后,胶原浓度为1 mg/mL、2 mg/mL培养体系中细胞饱满、多呈长梭形.胶原浓度为3 mg/mL的培养体系细胞多呈圆形并固缩.胶原浓度为2 mg/mL培养体系中,细胞存活率高(P＜0.05),细胞活性强于1 mg/mL组和3 mg/mL组(P＜0.05).2 mg/mL培养体系组扫描电镜结果显示细胞与胶原复合物黏附较好且细胞形态正常,HE染色结果显示细胞在胶原中分布均匀且细胞形态正常.结论 胶原浓度为2 mg/mL时,能够成功建立ROBs胶原水凝胶三维立体培养模型,该模型中胶原成形较好,硬度较高,细胞生存良好,分布均匀,能够维持正常形态及活性,适用于后期科学研究.
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TNF-α对三维立体培养的肺癌H460细胞MMP-2和MMP-9表达的影响
目的:研究肿瘤坏死因子-α对三维立体培养中的肺癌H460细胞基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的影响.方法:在天然活性Ⅰ型胶原中建立肺癌H460细胞三维立体培养模型,分为干预组和空白对照组,干预组加入肿瘤坏死因子-α,明胶酶谱法测定各组培养基中MMP-2、MMP-9的表达,采用Bergman法测定其中的羟脯氨酸含量,计算胶原降解量.结果:在肺癌H460细胞三维立体培养模型中,肿瘤坏死因子-α干预组MMP-2、MMP-9的表达高于空白对照组,胶原降解量高于空白对照组(P<0.05).结论:肿瘤坏死因子-α能上调MMP-2、MMP-9的表达,从而促进肺癌的侵袭与转移.
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肺癌细胞与成纤维细胞、炎症细胞相互作用对MMP-1,-2,-9表达的影响
目的:研究单个核细胞、胚肺成纤维细胞和肺癌H460细胞三维立体混合培养对MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的影响,并观察MMPs对胶原的降解作用.方法:活性胶原立体培养分为空白对照组(CG)、H460细胞组(HG) 、单个核细胞组(MG) 、胚肺成纤维细胞组(FG)、H460与单个核细胞混合组(HMG)、H460与胚肺成纤维细胞混合组(HFG)、三种细胞联合培养组(HMFG)共7组,观察癌细胞的生长状况,用明胶酶谱法测定MMP-2和MMP-9表达,Western blotting 法测定MMP-1.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好;CG与MG未明显分泌MMP-1、MMP-2 和MMP-9,其余各组均分泌MMP-1、MMP-2和MMP-9,但HMFG分泌的基质金属蛋白酶明显多于其他各组. 结论: 单个核细胞、成纤维细胞和癌细胞混合培养后,细胞间相互作用促进MMPs分泌;基质金属蛋白酶可降解细胞外基质(extraclluar matrix,ECM)和其它间质组织,进而促进肺癌的侵袭和转移.
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狗牙周膜细胞三维立体培养的体外实验研究
目的:探讨异体脱矿松质骨基质(CBM)和纳米羟基磷灰石材料(nHAC)两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性,为建立牙周组织工程的动物模型及下一步进行牙周组织工程的动物实验奠定实验基础.方法:组织块法培养狗牙周膜细胞,传代扩增后,接种于CBM和nHAC 2种三维支架上,体外继续培养3 d,进行细胞计数和扫描电镜观察.结果:狗牙周膜细胞在2种支架材料上均能形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见2种支架材料均具有良好的多孔网状结构,细胞在支架材料上生长旺盛,伸展充分.结论:CBM和nHAC均有望成为牙周组织工程的支架材料.
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人牙周膜细胞体外三维立体培养模型的建立
目的:建立人牙周膜细胞(PDLC)体外三维立体培养模型,初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性,为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础.方法:组织块法培养人PDLC,传代扩增后,接种于珊瑚和珊瑚转化羟基磷灰石(CHA)两种三维支架上,体外继续培养3d,进行细胞计数和扫描电镜观察.结果:细胞在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构,细胞在支架材料上生长旺盛,伸展充分.结论:可通过将人PDLC接种到珊瑚或CHA上建立体外三维立体培养模型,珊瑚和CHA均有望成为牙周组织工程的支架材料.
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H460细胞与单个核细胞三维立体混合培养中MMP-2和MMP-9的表达
目的:研究单个核细胞和肺癌细胞三维立体混合培养对MMP表达的影响.方法:活性胶原立体培养分为H460细胞组(HG)、单个核细胞组(MG)、混合组(HMG)3组,观察癌细胞的生长状况,用明胶酶谱法测定不同时间点各组MMP-2和MMP-9表达.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好;MG未明显分泌MMP-2和MMP-9,HG和HMG分泌MMP-2和MMP-9,且HGM分泌的明显多于HG.结论:单个核细胞和癌细胞混合培养后MMP分泌增多.
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肺癌H460细胞与单个核细胞相互作用对MMP-1、-2、-9表达的影响
目的:研究单个核细胞和肺癌H460细胞三维立体混合培养对MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的影响,并观察MMPs对胶原的降解作用.方法:活性胶原立体培养分为空白对照组(CG)、H460细胞组(HG)、单个核细胞组(MG)、混合组(HMG)共4组,观察癌细胞的生长状况.用明胶酶谱法测定不同时间点各组MMP-2和MMP-9表达,用Western blotting 法测定MMP–1.结果:各组细胞在立体胶原内生长良好.MG未明显分泌MMP-1、MMP-2 和MMP-9,HG和HMG均分泌MMP-1、MMP-2和MMP-9,但HMG分泌量明显多于HG.结论:炎症细胞和癌细胞混合培养后,细胞间相互作用促进MMPs分泌增多.基质金属蛋白酶可降解细胞外基质,进而促进肺癌的侵袭和转移.
