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下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离与鉴定
目的 对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养,并对分离菌株进行系统鉴定.方法 收集2010年3月至201 1年9月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为马拉色菌的下呼吸道分泌物标本133份,接种于含1％吐温60的科玛嘉琼脂培养基(即改良念珠菌显色培养基),于35℃大气环境中培养.挑取疑似菌落在含0.5％吐温40和0.5％吐温60的沙保弱平板上进行纯培养.采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定,包括染色镜检观察菌体形态及染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油试验,可疑菌株采用18s rRNA基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定.结果 镜检可疑的下呼吸道分泌物中马拉色菌分离率为47.4％ (63/133),63株分离菌经传统的表型鉴定方法结合l8srRNA基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌.标本直接涂片,用派克墨水染色镜下可明显区分马拉色菌和念珠菌.结论 糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色,可明显区别于其他念珠菌菌落,用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率.传统的表型鉴定结合基因序列分析可提高马拉色菌鉴定的准确性.
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18S rRNA基因序列分析在临床常见酵母样真菌鉴定中的应用
目的 应用18S rRNA基因序列分析技术对临床分离的常见酵母样真菌进行种的分类鉴定,且与传统方法比较,分析基因序列分析法鉴定临床常见酵母样真菌的可行性.方法 收集北京同仁医院微生物室菌库酵母样真菌115株,提取的DNA用18S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物直接测序,测序结果提交GenBank通过核酸序列比对对微生物种属进行鉴定,同时进行真菌显色培养基鉴定、Vitek 32 YBC鉴定,比较3种不同方法鉴定酵母样真菌的种鉴定准确率,阐明应用基因序列分析法鉴定临床酵母样真菌的可行性.结果 18S rRNA基因序列分析法与表型鉴定法相比较,有13株酵母样真菌鉴定结果存在差异:显色培养基仅鉴定出102株,与基因序列分析鉴定的符合率为89.2%(91/102),Vitek 32 YBC鉴定结果与基因序列分析鉴定的符合率为91.3%(105/115);显色培养基、Vitek 32 YBC和18S rRNA基因序列分析鉴定到种的比例分别为88.7%(102/115)、100%(115/115)、100%(115/115).结论 18S rRNA基因序列分析法呵对常见酵母样真菌进行准确分类.
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犬源环孢子虫的形态学与分子鉴定
目的 对犬粪中的疑似环孢子虫卵囊进行形态学和分子鉴定.方法 对首次在犬粪中发现的疑似环孢子虫卵囊的形状、大小、抗酸染色、孢子化和自发荧光等形态特征进行了观察.根据GenBank已发表的环孢子虫序列设计并合成3条引物,对犬源环孢子虫18SrDNA部分序列进行巢氏PCR扩增,将扩增产物纯化并克隆至载体pMD19-T,挑选阳性克隆测序并进行同源性及系统进化分析.结果 该疑似环孢子虫卵囊与人的环孢子虫卵囊形态特征相似,扩增的18SrDNA片段大小为715bp,与预期目的片段一致.序列同源性和系统发育分析显示该犬源环孢子虫与环孢子虫间的相似性高,系统进化树中处于同一分支.结论 首次从犬粪中发现的疑似环孢子虫卵囊可以确定为环孢子虫.
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基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅰ)——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别
目的:分析半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.及其伪品虎掌南星Pinellia pedatisecta Schott的核基因组序列,为半夏正品基原鉴别提供分子依据.方法:采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18S rRNA基因核苷酸序列并作序列变异和选择性内切酶谱(PCR-SR)分析.结果:半夏和伪品的18S rRNA序列长度均为1805 bp,根据排序比较,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同,虎掌南星亦如此.而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异(有 4个变异位点).在半夏18S rRNA序列中有一个限制性内切酶Ase Ⅰ识别位点,通过PCR-SR图谱显示800 bp和900 bp 2个酶切片断,而虎掌南星则无此位点,PCR-SR图谱显示1个未消化的1800 bp片断.结论:通过核基因组序列和PCR-SR图谱差异, DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法.
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小鼠死后脑RNA降解与死亡时间的相关性
目的 探讨小鼠死后不同时间和温度下脑组织β-actin mRNA、18S rRNA的降解规律与死亡时间的关系.方法 将24只健康成年C57BL/6小鼠随机分为2组,每组12只,断颈法处死后分别置于不同的环境温度中(4℃、37℃),恒定环境湿度为80%.分别于死后即刻和0.5、2、6、24、48h取小鼠脑组织进行总RNA提取.利用RT-PCR技术和实时荧光定量PCR技术测定每一样本中β-actin mRNA和18S rRNA的Ct值,进一步计算每个样本中18S rRNA与β-actin mRNA的含量比值,对二者含量比值与死亡时间的关系进行统计学回归分析.结果 37℃下,RNA降解速度明显快于4℃,表明温度与死后RNA的降解速度呈正相关.与β-actin mRNA的稳定性相比,18S rRNA更为稳定.结论 通过采用实时荧光定量PCR技术研究小鼠死后脑组织中β-actin mRNA和18S rRNA的降解规律,可为法医学死亡时间推断提供新的理论基础.
