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SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响
目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向siRNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向siRNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Westernblot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×108 TU/mL,1.49×109TU/mL及8.50×108 TU/mL,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86,00％、74.85％及19.22％,效果优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率＞80％.结论:成功构建携带SMO基因靶向siRNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.
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靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA:筛选和评价
背景:研究表明,T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关.Smo基因是该信号通路中的关键基因,控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递.目的:筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA).方法:①根据siRNA设计原理,设计并化学合成Smo-siRNA 1,2,3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA;②利用NuclefectorTM核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞),分别在转染24,48,72 h 采用 qRT-PCR 检测 Smo mRNA 相对表达水平,CCK-8法检测细胞生长抑制率, Hoechst33258 染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡率.结果与结论:①利用NuclefectorTM核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞,Smo-siRNA 1沉默效果佳,有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P < 0.05),并且以48 h作用效果明显;②转染后24 h, Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P < 0.05);③Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化;④与对照组比较,Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P < 0.05);⑤结果表明,小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖,并促进凋亡,提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能.
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Cx43与Smo基因在胰腺癌中的表达及其临床意义
目的:研究细胞间隙连接蛋白43(Cx43)与信号通路基因Smoothened(Smo)在胰腺癌中的表达及其临床意义.方法:选择从2013年1月～2015年12月在医院接受手术治疗的胰腺癌患者53例切除组织及与癌组织相配对的3cm外癌旁组织,对比不同胰腺组织中Cx43与Smo阳性表达率,及Cx43mRNA与Smo mRNA表达水平,分析胰腺癌组织中Cx43和Smo表达与胰腺癌的病理特征之间的关系及两者的相关性.结果:胰腺癌组织中Cx43的阳性表达率及Cx43 mRNA表达水平明显低于在癌旁组织,而Smo的阳性表达率及Smo mRNA表达水平明显高于癌旁组织,差异均有统计学意义(均P＜0.05).胰腺癌患者组织学分级为Ⅲ级、有淋巴结转移者的Cx43 mRNA表达水平分别明显低于Ⅰ～Ⅱ级、无淋巴结转移者,Smo mRNA表达水平则明显高于Ⅰ～Ⅱ级、无淋巴结转移者,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Pearson相关性分析结果发现,胰腺癌组织中Cx43mRNA和Smo mRNA表达呈负相关关系(r=-0.846,P=0.000).结论:Cx43mRNA在胰腺癌中的表达下降,而Smo mRNA则表达上调,临床监测Cx43及Smo基因的表达情况,有助于评价患者的病情与预后.
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SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建
目的 构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率高的siRNA.方法 根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒.用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装.结果 测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率高.包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒.结论 成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础.
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Smo小干扰RNA对人食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过Smoothened (Smo)基因位点阻断Hh信号通路抑制食管癌细胞增殖,并诱导其凋亡.方法 运用Smo小干扰RNA(siRNA)转染食管癌EC9706细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测各组细胞Smo和Glil mRNA及蛋白表达,并以噻唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测SmosiRNA对细胞增殖及凋亡的影响.结果 (1)Smo siRNA转染细胞24、48和72 h后,Smo mRNA相对表达量分别为4.20±1.10、2.80±1.10和1.00±0.71；GlilmRNA相对表达量分别为4.60±1.34、3.00±0.71和1.20 ±1.10,与各对照组比较均明显降低(P＜0.05)；(2) Smo siRNA转染细胞72 h后,Smo和Glil蛋白相对表达水平分别为0.330±0.016和0.324±0.021,与各对照组比较均明显下降(P＜0.05)；(3)SmosiRNA转染细胞72 h后,细胞生长抑制率为(88.06±7.56)％,明显高于各对照组,并随转染时间延长抑制率升高(P＜0.05)；(4)SmosiRNA转染细胞72h后,早期凋亡细胞所占的比例均明显增高.结论 Smo基因具有调控食管癌细胞增殖和凋亡的作用.
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胶质瘤相关Hedgehog信号通路的研究进展
胶质瘤是中枢神经系统常见的原发性恶性肿瘤,传统治疗主要包括肿瘤切除、放疗及化疗,但肿瘤侵袭性强,术后复发率高.Hedgehog这一高度保守的细胞信号传导通路,广泛参与胚胎的发育和多种病理生理过程,且许多研究已证实该通路在较高比例的胶质瘤中异常活化,在肿瘤发生、发展中的作用也逐渐揭示.这为研究胶质瘤的发病机制及诊断治疗提供新的思路.本文就Hedgehog通路在胶质瘤中的研究进展进行综述.
关键词： 神经胶质瘤 Hedgehog信号通路 PTCH基因 SMO基因 Gli蛋白
