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PTD-NBD多肽对大鼠胰腺腺泡细胞炎症损伤中NF-κB表达的影响
目的:探讨PTD-NBD多肽对体外大鼠胰腺腺泡细胞核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)p65的表达影响.方法:分离培养大鼠胰腺腺泡细胞,分为正常对照组、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)组和PTD-NBD多肽组,用脂多糖(10mg/L)诱导体外细胞AP模型,分别于建模6和12 h观察细胞形态学变化,培养液中淀粉酶(amylase,AMY)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和白介素(interleukin,IL)-1β含量,RT-PCR和免疫印迹法检测细胞中NFKB p65 RNA及其蛋白表达.结果:与对照组相比,AP组各时间点腺泡细胞发生肿胀和死亡增多(细胞形态学评分:6 h:8.90±0.34 vs l.10±0.13; 12 h:9.40±0.26 vs 1.20±0.15,P＜0.05),培养液中AMY升高(6 h:2135.8±347.2 vs 873.5±91.6; 12 h:3299.6± 217.7 vs 917.7±101.9,P＜0.05),IL-1β含量升高(6 h:84.9±15.7 vs 39.3±7.9; 12 h:95.6±17.1 vs 38.9±5.2,P＜0.05),SOD含量降低(6 h:116.3±30.3 vs 176.2±21.6; 12 h:101.5±25.6 vs 173.6±27.9,P＜0.05),细胞中NF-KB p65RNA及其蛋白表达量增多(P＜0.05)；与AP组比较,经PAT-NBD多肽预处理后腺泡细胞出现肿胀和死亡减少(细胞形态学评分:6 h:6.80±0.23 vs 8.90±0.34; 12 h:7.50±0.19 vs 9.40±0.26,P＜0.05),培养液中SOD上升(6 h:137.6±27.4 vs 116.3±30.3; 12 h:144.3±23.6 vs101.5±25.6,P＜0.05),AMY下降(6 h:1951.5±211.7 vs 2135.8±347.2; 12 h:1761.3±231.5 vs3299.6±217.7,P＜0.05),IL-1β含量明显下降(6 h:66.8±11.6 vs 84.9±15.7; 12 h:54.8±21.2 vs95.6±17.1,P＜0.05),NF-KB p65蛋白表达降低(P＜0.05).结论:PTD-NBD多肽透过大鼠胰腺腺泡细胞膜抑制脂多糖刺激的NF-κB p65活化及其活性,下调IL-1β表达,上调SOD含量,从而减轻胰腺腺泡细胞的炎症损伤.
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NBD多肽促进成骨细胞分化的实验研究
[目的]探讨核因子κB必需分子(NF-κB essential modulator,NEMO)结合的小分子多肽(NEMO binding domain,NBD)通过阻断肿瘤坏死因子-α信号通路影响成骨细胞分化的作用及其分子机制.[方法]应用BMP -2体外诱导鼠肌源细胞C2C12向成骨细胞分化模型,外源添加TNF-α和/或BMP -2细胞因子培养,通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测,瞬时转染和基因测定,研究NBD多肽对抗NF-κB活性和改善TNF-α抑制成骨细胞分化的过程.[结果]ALP染色显示NBD多肽能明显阻断TNF-α对C2C12向成骨细胞分化的抑制而促进其分化,荧光素酶活性测定显示TNF-α降低BMP -2活性从7.12倍到1.31倍,而NBD多肽使其恢复到6.7倍和mNBD肽恢复到1.4倍.[结论]TNF-α抑制成骨细胞分化的分子生物机制是通过激活NF-kB阻碍成骨细胞的分化.NBD多肽具有对抗NF-κB活性和改善TNF-α抑制成骨细胞分化过程的作用.
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NBD多肽对小鼠移植心存活时间的影响及机制探讨
目的 探讨NBD多肽对小鼠移植心脏存活时间的影响及机制.方法 以BALB/c小鼠为供体、C57BL/6小鼠为受体,采用Cuff技术建立小鼠颈部异位心脏移植模型.随机分为对照组及NBD多肽组,各9只.NBD多肽组于心脏移植术中和术后第2、3天全身给予NBD多肽600μg/d,而对照组仅给予等体积PBS 0.2 ml.记录移植心脏存活时间,排斥反应程度,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定受者脾脏T细胞对供者同种抗原的反应性.ELISA法测定受者血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(INF)-γ和白细胞介素(IL)-12.免疫组化法检测移植心脏NF-κB.结果 NBD多肽组移植心脏存活(14.17±2.93)d,与PBS对照组的(7.00±1.41)d相比,P<0.01.NBD多肽组排斥反应分级降低,诱导受者脾脏T细胞的抗原特异性低反应性,受者小鼠血清Th1型细胞因子(TNF-α、INF-γ和IL-12)水平显著降低(P均<0.01),移植心脏NF-κB的表达下调.结论 NBD多肽能有效抑制小鼠心脏移植排斥反应,使同种异体的心脏移植存活时间延长.其机制可能与诱导受者T细胞的抗原特异性低反应性及抑制Th1型细胞因子分泌有关.
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NBD多肽预处理对局灶脑缺血再灌注大鼠脑内核因子-κB核转位活化的影响
目的 探讨NBD多肽预处理对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑缺血皮质细胞内核因子-κB活化的影响.方法 将SD健康雄性大鼠(280~300 g)共36只随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=15)、药物组(n=15).缺血模型制备前2 h经右侧侧脑室注射NBD多肽25 μl进行预处理.运用改良线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞再灌注大鼠模型.运用免疫组化检测再灌注后72 h NF-κB p65在胞浆/胞核的蛋白表达变化;运用免疫荧光定位及Western印迹(半定量)检测NF-κB p65及IκBα的蛋白表达情况.结果 免疫组化结果显示与假手术组比较,再灌注72 h模型组胞浆/胞核内NF-κB p65大量表达(P<0.05);NBD多肽预处理后NF-κB p65主要在胞浆表达,胞核内表达明显减少(P<0.05);免疫荧光双标定位及Western印迹半定量检测显示模型组胞浆/胞核内NF-κB p65蛋白均大量表达(P<0.05),IκBα蛋白呈现低表达(P<0.05);NBD多肽预处理后胞核内NF-κB p65蛋白表达明显减少,主要以胞浆表达为主(P<0.05),IκBα胞浆/胞核内表达显著增加(P<0.05).结论 局灶脑缺血再灌注72 h NF-κB p65蛋白胞核表达明显增加,NF-κB核转位/活化过程被激活;NBD多肽预处理后通过增加胞核/胞浆内IκBα表达有效阻止NF-κB的核转位/活化过程,从而有效地减轻再灌注后72 h局灶脑缺血再灌注对脑组织的损害.
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基于同位素标记相对和绝对定量技术核因子-KB必需分子结合的小分子多肽改善肿瘤坏死因子-α抑制成骨细胞分化的蛋白质组学研究
目的 应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术观察核因子-κB(NF-κB)必需分子结合的小分子多肽(NBD)干预肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下成骨细胞分化过程中蛋白质表达组的变化.方法 肌原C2C12细胞接种于骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体系中诱导作为分化细胞模型,实验分为3组:对照组(B组)即分化细胞模型未加其他刺激,实验组(BT组)即分化细胞模型添加TNF-α,干预组(BTP组)即分化细胞模型添加TNF-α及NBD多肽,共同孵育分化7d后提取蛋白,以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测并以软件分析差异表达的蛋白质.结果 TNF-α明显抑制成骨细胞分化,而NBD多肽可部分改善TNF-α对成骨细胞分化的抑制.iTRAQ试剂标记的B组与B+T组细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为76个,表达上调的蛋白质点59个,下调的蛋白质点17个;BT组与BTP组细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为43个,表达上调的蛋白质点25个,下调的蛋白质点18个.其中3组间成骨细胞特异因子(Postn)、ATP酶钙离子运输因子(Atp2a3)、SR依赖蛋白CTD关联因子-1(Scafl)、肌动蛋白-F交联蛋白(Actn2)、ATP合成酶,氢离子转运,线粒体复合体-F1,Delta亚基(Atp5d)、延伸体乙酰转移酶复合体亚基-2(Elp2)、Atp5]、C1型尼曼-匹克疾病(Npc1)等8个蛋白表达出现动态变化,提示上述蛋白可能与炎症刺激成骨分化机制有关,NBD多肽之外尚有其他药物靶点干预炎症对成骨分化的抑制.结论 iTRAQ技术是研究细胞分子蛋白改变的有效的蛋白质组学方法.Postn、Atp2a3、Scaf1、Actn2、Atp5d、Elp2、Atp5l及Npc1可能作为炎症刺激成骨分化机制研究的候选靶标.
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NBD多肽预处理的树突状细胞延长移植心存活时间的实验研究
目的 探讨NBD多肽预处理的供体源性树突状细胞(DC)在诱导心脏移植免疫耐受中的作用及可能机制.方法 体外培养供体源性BALB/c小鼠骨髓树突状细胞并以NBD多肽预处理(NBD多肽-DC,在小鼠心脏移植前7 d,将NBD多肽.DC输至受者C57BL/6小鼠体内.应用Cu-T建立小鼠颈部异位心脏移植模型,观察心脏移植物存活时间,病理分析检测排斥反应程度.混合淋巴细胞反应(MLR)测定受者脾脏T细胞对供者同种抗原的反应性,并用ELISA方法测定受者血清Thl型细胞因子(IFN-γ和IL-12)和Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)水平的变化.结果 NBD多肽-DC可使移植心脏存活天数延长至(21.83±3.54)d,较PBS对照组的(6.66±1.21)d明显延长(P＜0.01),降低排斥反应病理分级(Stanford 1～2级),能诱导受者脾脏T细胞的抗原特异性低反应性,使受者小鼠血清INF-γ和IL-12水平显著降低(P＜0.01).而IL-4和IL-10水平明显升高(P＜0.01).结论 NBD多肽预处理的供体源性DC能够诱导针对移植供者产生的特异性免疫耐受现象,其机制可能与诱导受者T细胞的抗原特异性低反应性及Th1/Th2免疫偏移有关.
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NBD多肽治疗实验性溃疡性结肠炎的实验研究
目的 观察核因子κB必需分子(NF-κB essential modulator,NEMO)结合的小分子多肽(micromolecule polypeptide combining with NEMO-binding domain,NBD多肽)对实验性大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用.方法 60只SD大鼠随机分成治疗组、对照组各30只,采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法制作溃疡性结肠炎大鼠模型,治疗组予腹腔注射1.3 mg/100 g体质量的NBD多肽,对照组予等量生理盐水,评估炎症活动指数(IAI),给药后7 d处死相应组的动物取结肠,肉眼观察结肠黏膜病变且按损伤情况积分,行病理切片、苏木素伊红(hematoxylin eosin,HE)染色,光镜下评估组织损伤;取病变结肠组织切片行免疫组化检测核因子κB(NF-κB)表达,检测髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA).结果 治疗组大体形态损伤、组织学损伤评分、IAI评分分别为2.41±0.43、4.80±0.82、6.02±0.59,明显低于对照组(3.50±0.51、6.90±1.13、3.05±0.51)(P＜0.05);治疗组MDA、MPO及NF-κB表达均低于对照组(P＜0.05).结论 NBD多肽对于溃疡性结肠炎大鼠模型有较好的治疗作用,其作用与其抑制NF-κB表达有关.
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NBD多肽预处理改善大鼠肝移植缺血再灌注损伤的研究
目的 采用SD-SD大鼠原位肝移植模型,观察NBD多肽预处理供肝对术后肝脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的影响,并探讨其可能的保护机制.方法 105只SD大鼠采用抽签法随机分为3组,NBD预处理组(24对动物,供体术前2h经腹腔注射8 mg/kg的NBD多肽并建立原位肝移植模型)、移植组(24对动物,注射同体积的生理盐水作为对照)和假手术组(9只动物).术后3、6、24h分别处死动物,检测3组中ALT水平,ELISA检测血清中TNF-α含量.取NBD预处理组和移植组肝脏组织,HE染色观察肝脏病理学改变.采用TUNEL检测肝细胞凋亡,EMSA检量NF-κB转录活性,Western blot检测p-IKK-2和IκBα在肝组织的表达.结果 NBD预处理组和移植组术后各时间点的ALT水平、TNF-α含量均明显高于假手术组.NBD预处理组中ALT水平、NF-κB活性、p-IKK-2表达、TNF-α含量较移植组均明显降低(P＜0.05);IκBα表达则较移植组明显增强(P＜0.05);术后6 h,NBD预处理组中病理损伤、凋亡细胞较移植组明显减轻.结论 NBD多肽预处理供体可通过抑制供肝中NF-κB活性,有效改善肝移植IRI.
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NBD多肽与OPG联合抑制聚乙烯磨损颗粒诱导的溶骨效应
目的 运用小鼠植骨气囊模型,研究 NBD 多肽、NBD 多肽联合骨保护素（osteoprotegerin,OPG）减少骨破坏吸收防治人工关节松动的效应.方法 在小鼠背部注入空气形成气囊,取同源小鼠的颅骨植入气囊内.将已制成的气囊模型的小鼠分成3组:NBD多肽组（气囊内注入聚乙烯颗粒及NBD多肽）；联合组(气囊内注入聚乙烯颗粒、NBD多肽及OPG)；对照组（气囊注入聚乙烯颗粒及生理盐水）.3周后取囊壁和植入颅骨组织进行HE染色检测炎症反应情况及炎症细胞渗出量；取组织匀浆液应用ELISA方法检测炎性细胞因子(IL-1、TNF)浓度；抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的分化成熟情况；应用扫描电镜检测骨片吸收情况及RT-PCR检测破骨细胞骨吸收相关基因Ⅱ型碳酸酐酶（CA-Ⅱ）mRNA表达水平.结果 ①HE染色检测炎症细胞渗出量NBD多肽组(870±236)、联合组(820±198)明显少于对照组(3 325±467)（P＜0.05）.②ELISA法检测炎性细胞因子(IL-1、TNF)浓度NBD多肽组[（138.34±2.32）、(156.14±4.17)]与联合组[( 129.32±4.62)、(148.78±5.36)]均明显低于对照组[（187.56±4.78）、(179.45±8.34),P＜0.05].③抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域与视野面积的百分比NBD多肽组[(1.06±0.67)％]与联合组[(0.64±0.33)％]明显少于对照组[(4.12±1.09)％],且联合组较NBD多肽组染色面积也有显著减少(P＜0.05).④应用扫描电镜检测骨片吸收陷窝面积与视野面积的百分比NBD多肽组[(4.03±0.76)％]与联合组[(2.65±0.58)％]明显低于对照组[(12.38±1.98)％]；且联合组较NBD多肽组的骨片吸收面积有显著减少(P＜0.05).⑤破骨细胞骨吸收功能相关基因CA-ⅡmRNA相对表达量NBD多肽组(0.254±0.048)与联合组(0.180±0.033)明显少于对照组(0.382±0.072).且与NBD多肽组相比,联合组表达水平也有显著减少(P＜0.05).结论NBD多肽能明显减轻聚乙烯磨损颗粒所致的炎症反应,从而间接抑制破骨细胞激活,有效减少聚乙烯磨损颗粒所致的骨吸收效应；NBD多肽与OPG联合应用,其抑制骨吸收效应更加明显.
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NBD多肽抑制HSP60诱导的小鼠骨髓树突状细胞激活
目的 观察热休克蛋白60(HSP60)对小鼠骨髓树突状细胞(dendritic cell,DC)生物学活性的影响,并探讨核因子κB必需分子(NF-κB essential modulator,NEMO)结合的小分子多肽(NEMO binding domain,NBD)对DC活性的干预作用,为NBD多肽的临床应用提供理论依据.方法 培养小鼠骨髓源性DC,分为对照组、HSP60组及NBD组,对照组在正常条件下培养,HSP60组加入终质量浓度为10 μg/ml的HSP60,NBD组在加入NBD(50 μmol/ml)4 h后给予10 μg/ml的HSP60刺激,继续培养3d.流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的变化,ELISA法检测各组DC分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-12(IL-12)的质量浓度,免疫细胞化学检测DC核因子-κB(NF-κB)的表达,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力.结果 HSP60可促进DC高表达CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子,促进Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ及IL-12释放、NF-κB高表达并易位于核内,并诱导T细胞增殖,NBD多肽可阻断HSP60的这些效应.结论 NBD多肽可抑制HSP60诱导的DC激活.
