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细小病毒H-1非结构蛋白NS1在人肝癌细胞内的超显微结构定位
目的研究细小病毒H-1非结构蛋白NS1对体内人肝癌细胞的抑制作用机制方法利用免疫胶体金标记电镜技术,在感染细小病毒H-1后不同时间,观察了病毒非结构蛋白NS1在人肝癌裸小鼠QGY-9204移植瘤模型细胞内的超显微结构定位.结果研究表明,在感染后4 h,H-1病毒的NS1蛋白主要集中在核仁内;感染后12 h,NS1蛋白由核仁内向常染色区转移;感染后24 h,常染色区的NS1蛋白逐渐增多并且向核外扩散;感染后72 h,核内和胞质内NS1蛋白越来越多,与此同时,细胞核圆缩,核仁消失.H-1 NS1蛋白表达在细胞内的定位过程与H-1DNA复制的定位相一致.用原位杂交研究表明,在感染24 h,阳性杂交颗粒仅在少数细胞核内出现,在感染后72 h,核内阳性杂交颗粒增多并向核外扩散.结论 NS1从核仁扩散到细胞质,辅证了NS-1蛋白在病毒生活周期和抑制肿瘤细胞生长中起重要作用.
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细小病毒H-1感染对胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响
背景:细小病毒H-1对肿瘤细胞和转化细胞具有选择性杀伤和抑制生长的作用,是很好的基因治疗用载体.但肿瘤细胞对细小病毒H-1杀伤作用敏感或耐受的分子机制目前尚不十分清楚.目的:从mRNA水平观察细小病毒H-1感染对胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响,探讨细小病毒H-1对胃癌细胞细胞毒作用的相关机制.方法:选取对细小病毒H-1敏感的人胃癌细胞株HGC-27和不敏感的人胃癌细胞株BGC-823,于细小病毒H-1感染48 h后提取细胞总RNA.应用不同荧光染料标记的dUTP逆转录制备荧光探针,与含有8 000点人类体细胞基因序列的基因表达谱芯片杂交,再经计算机荧光扫描以分析敏感细胞株HGC-27凋亡相关基因表达谱的改变.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对敏感细胞株HGC-27部分凋亡相关基因,如SARP1、BCL-10、CL-20、NCDRP和RAIDD等的表达作进一步检证,并比较其与不敏感细胞株BGC-823相应凋亡相关基因的表达差异.结果:基因表达谱芯片检测结果显示,HGC-27细胞感染细小病毒H-148 h后,所检测的64对凋亡相关基因中有15对基因表达水平下调至原水平的50%以下,仅有1对基因表达水平上调至2倍以上.RT-PCR扩增结果显示,感染细小病毒H-1 48 h后,敏感细胞株HGC-27的SARP1、BCL-10、CL-20和NCDRP基因表达明显下调,RAIDD基因表达无明显改变;不敏感细胞株BGC-823的BCL-10和NCDRP基因表达明显上调,CL-20和RAIDD基因表达无明显改变,SARP1基因则不表达.结论:细小病毒H-1对胃癌细胞的细胞毒作用可能是通过上调和(或)下调一些凋亡相关基因的表达来实现的,即可能与其影响胃癌细胞凋亡通路相关基因的表达有关.
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细小病毒H-1诱导胃癌细胞死亡分子机制的基因表达谱研究
背景:自主性细小病毒H-1在活体组织中具有肿瘤抑制活性,并且在细胞培养中能特异地干扰转化细胞或肿瘤细胞的生存,但其诱导转化细胞死亡的分子机制尚不十分清楚.目的:研究细小病毒H-1诱导人胃癌细胞株HGC-27死亡时HGC-27细胞基因表达的变化,进而为阐明细小病毒H-1的抗肿瘤机制奠定基础.方法:采用四唑蓝(MTT)比色法分析HGC-27细胞在感染细小病毒H-1后不同时间点的存活率;分别收集纯化细小病毒H-1感染前和感染48 h后HGC-27细胞的mRNA,应用基因表达谱芯片技术研究HGC-27细胞感染细小病毒H-1后的基因表达变化.结果:HGC-27细胞从感染细小病毒H-1后的第3天开始,细胞存活率呈明显下降趋势;感染细小病毒H-1 48 h后,基因表达谱发生了明显的变化,表达改变基因约占被检测基因的11.5%(920/8 000),363对基因的表达明显下调,557对基因的表达明显上调.其中与细胞信号传导、细胞周期、细胞凋亡相关的部分基因表达改变与细小病毒H-1诱导的细胞死亡通路相关;而与DNA合成和修复、代谢以及蛋白质合成相关的部分基因表达改变可能与细胞对外界刺激的防御反应相关.结论:细小病毒H-1诱导人胃癌HGC-27细胞死亡的过程是以一种细胞依赖的方式进行的,并涉及细胞中多个促进死亡的信号传导通路.细小病毒H-1诱导胃癌细胞死亡以及胃癌细胞自身防御反应中所展示的基因表达差异谱,为研究细小病毒H-1抗肿瘤作用的分子机制提供了初步的线索.
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转染及表达细小病毒H-1非结构蛋白1基因对人胃癌细胞的抑制作用
目的 探讨细小病毒H-1非结构蛋白1(NS1)基因对人胃癌细胞的抑制作用及其可能的机制.方法 构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标记的NS1重组质粒(peGFP-C1-NS1),分别使用peGFP-C1-NS1(实验组)或空载体质粒(peGFP-C1,阴性对照组)转染人胃癌SGC7901细胞株,空白对照组则予等量磷酸盐缓冲液处理.转染后在荧光显微镜下观察细胞内荧光信号分布,检测NS1基因及蛋白表达情况.绘制细胞生长曲线,检测细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的表达,并使用流式细胞仪分析细胞周期分布变化.两组间比较行t检验.结果 转染peGFP-C1-NS1后SGC7901细胞表达NS1基因及蛋白,与阴性对照组相比,实验组细胞荧光信号集中于细胞核内.实验组SA-β-Gal阳性细胞比例[(30.5±1.4)％]高于阴性对照组[(4.4±1.1)％],差异有统计学意义(t=-12.931,P＜0.01).转染peGFP-C1-NS1后1、2、3、4 d SGC7901细胞的抑制率分别为45％、62％、73％、77％.表达eGFP-NS1融合蛋白的SGC7901细胞细胞周期被阻滞于G0/G1期.结论 细小病毒H-1 NS1在胃癌SGC7901细胞核内发挥作用,可将细胞周期阻滞于G0/G1期,有效抑制SGC7901细胞生长.
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胃癌细胞对细小病毒H-1敏感性差异的实验研究
目的探讨不同胃癌细胞株对细小病毒细胞毒作用的敏感性差异及可能的机制.方法共选用HGC27(未分化)、BGC823(未分化)、MKN45(低分化)、AGS(低分化)、SGC7901(中分化)和MKN28(高分化)等6株不同分化状态的胃癌细胞株,用流式细胞仪分析其各自的细胞周期,H-1病毒感染后采用MTT方法检测不同胃癌细胞株对其细胞毒作用的敏感性差异,用RT-PCR来检测H-1病毒中的非结构蛋白基因(NS-1)在6株不同胃癌细胞中的表达.结果HGC27、BGC823、MKN45、AGS、SGC7901和MKN28等不同分化状态细胞株中,S期细胞的比率分别为24.72%,30.15%,27.10%,29.03%,31.82%和33.73%.其中HGC27细胞对H-1病毒的细胞毒作用敏感;SGC7901细胞其次;MKN45、AGS细胞对H-1病毒的细胞毒作用中等敏感;MKN28细胞对H-1病毒的细胞毒作用不敏感;而BGC823则对H-1病毒的细胞毒作用抵抗.病毒NS-1的mRNA在HGC27、BGC23、MKN45和SGC7901等细胞中的表达水平较高,而在AGS和MKN28中的表达水平却较低.结论H-1病毒的细胞毒作用在不同的胃癌细胞株中的差异显著.总体上,与高分化细胞株MKN28细胞相比,分化差的细胞对细小病毒H-1的细胞毒作用敏感性增加.其机制至少部分与分化差细胞中病毒NS-1蛋白的产生和积聚能力增高相关.未分化的BGC823细胞对H-1病毒的细胞毒作用抵抗,进一步证实并非所有的肿瘤细胞都对细小病毒的溶胞性作用敏感.
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细小病毒H-1感染对有丝分裂原激活蛋白激酶信号传导相关基因表达的影响
目的探讨具有选择性杀伤和抑制肿瘤细胞生长特性的细小病毒H-1所诱导的胃癌细胞死亡的信号传导通路及可能机制.方法采用RT-PCR的方法,检测H-1病毒感染后胃癌细胞HGC27的有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导途径相关基因在mRNA水平的表达改变.结果MAPK信号传导相关基因的扩增结果显示:在H-1病毒感染HGC27细胞48 h后,细胞CREB基因的表达明显增高,ERK1、STAT2、p38-7、MEK2、β-RAF、MTK1基因的表达明显降低,而JNK2、ETS、ERK2基因在mRNA水平的表达无明显改变.结论细小病毒H-1的细胞毒作用可能与其影响胃癌细胞MAPK信号传导途径中相关基因的表达有关.即H-1病毒通过干预癌细胞信号传导的特定通路而诱导细胞死亡.由此我们认为,可修饰改造的细小病毒H-1,将是抗肿瘤研究中的一个非常有价值的工具.
关键词： 胃癌 细胞 细小病毒H-1 有丝分裂原激活蛋白激酶 信号传导 -
细小病毒H-1对正常仓鼠肝肾脏器功能及形态的实验研究
目的探讨细小病毒H-1对成年仓鼠肝肾脏器的影响.方法采用正常成年金黄仓鼠腹腔内注射细小病毒H-1(5×106 pfu、1×108 pfu两组),动态观察动物血清肝肾功能及病理形态变化.结果反映肝功能的血清学指标如SGPT和SCOT、反映肾功能的指标如BUN和肌肝(Cr)在实验动物组与对照动物组之间无显著性差异(P＞0.05).病理组织学及超微结构观察发现:动物在接种PVH-1的当天、3 d及7 d时,肝脏组织学无明显变化,第14 d极小部分肝脏呈现轻度炎症表现;可见散在分布的少数肝细胞气球样变性、点状坏死.电镜下可见少数肝细胞胞浆疏松、线粒体肿胀.但是在接种后第30 d及第90 d肝脏组织学已无明显炎症性变化.电镜下可见肾小球结构清晰、系膜细胞形态正常.结论本实验证实:细小病毒H-1对成年健康仓鼠肝细胞有一过性、轻微损伤,对肾脏无明显不良反应.
