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成骨细胞特异性过表达h1 calponin转基因小鼠的建立
目的 为从整体动物水平研究碱性调宁蛋白(h1-calponin)在骨形成过程中的直接作用,我们构建了成骨细胞中特异性过表达h1-calponin的转基因小鼠模型,并对其表型进行了初步分析.方法 构建在成骨细胞特异性启动子(collagen I promoter)驱动下表达h1-calponin的载体(pColI-calponin),纯化DNA片段,再以显微注射的方法将转基因片段导入小鼠受精卵,经移植后得到小鼠.PCR法检测整合到小鼠基因组中的外源基因,提取F1代阳性小鼠原代成骨细胞RNA,RT-PCR检测h1-calponin在小鼠成骨细胞中的表达情况,并观察转基因小鼠表型及体重变化情况.结果 PCR检测结果显示1只G0代转基因鼠中检测到阳性信号,RT-PCR显示F1代转基因小鼠成骨细胞中表达h1-calponin较野生对照小鼠明显增加,且转基因小鼠体重与野生小鼠相比有明显降低.结论 成功构建了在成骨细胞特异性过表达h1-calponin的转基因小鼠,为深入研究h1-calponin在骨骼发育中的作用提供了良好的动物模型.
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利用pSOS-HUS系统构建针对小鼠h1-calponin的RNA干扰载体
目的 利用pSOS-HUS系统构建针对小鼠碱性调宁蛋白(h1-calponin)的RNA干扰载体并对其干扰效率进行验证.方法 利用在线软件设计三段针对小鼠h1-calponin cDNA的寡核苷酸(A、B、C)片段,经退火成为双链后分别装入pSOS-HUS载体,得到载体调宁蛋白-PS-A/B/C,再将h1-calponin cDNA插入该载体和GFP一起融合表达,得到调宁蛋白RNAi-A/B/C 3个载体;对上述载体经酶切和测序鉴定后,转染至HEK293T细胞株,通过倒置荧光显微镜观察GFP荧光强度来判断上述载体的干扰效果.结果 经酶切和测序证明针对小鼠h1-ealponin的3个RNA干扰载体构建成功,荧光显微镜下观察显示,和空载体pSOS-HUS(未插入RNA干扰片段)相比,A组的荧光强度减弱明显,B的基本不变,C的荧光强度稍有减弱.结论 成功构建了针对h1-calponin的RNA干扰载体.
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大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎TGF-β1和calponin h1表达变化的初步研究
目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性调宁蛋白(calponin h1)在大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎中的表达及其意义.方法制备大鼠抗Thy-1系膜增生性肾肾炎模型,提取其肾组织的总蛋白和总RNA.应用免疫组织化学ABC法、Western blot、RT-PCR等方法分别从蛋白和核酸水平检测TGF-β1和calponin h1在肾炎模型1、3、5、7、14、21、28 d组织中的表达,研究其相互关系.结果大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎中TGF-β1的蛋白表达从7天组起明显随时间延长增强,至21 d组达高峰后回落,核酸表达差异不明显;calponin h1的少量表达见于正常对照组,1、3、5 d组起表达明显增强,7 d组达到高峰后开始回落,核酸表达的变化趋势则与TGF-β1的蛋白表达变化趋势一致.结论大鼠抗Thy-1系膜增生性肾炎组织中calponin h1表达增强,并在肾炎病变早期呈增强趋势,后者与TGF-β1在肾炎早期的增强表达趋势相似.calponin h1可能在肾炎早期发挥抗细胞增殖的作用.
关键词： 转化生长因子-β1 碱性调宁蛋白 细胞增殖 抗Thy-1肾小球肾炎 -
内皮素-1在糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化中作用
目的 探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)在糖尿病性勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSM)表型转化中的作用.方法 采用链脲佐菌素建立糖尿病性ED大鼠模型,采用改良组织块贴壁法体外培养正常大鼠及糖尿病性ED大鼠CCSM,将CCSM分为对照组、糖尿病性ED组、对照+ET-1组和糖尿病性ED+ET-1组,其中对照+ET-1组与糖尿病性ED+ET-1组加入10-7 mol/L ET-1,对照组与糖尿病性ED组加入PBS缓冲液.采用RT-PCR法检测4组碱性调宁蛋白(calponin 1,Cnn1)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN) mRNA表达情况.结果 糖尿病性ED+ET-1组Cnn1 mRNA表达水平(3.51±0.15)低于对照组(10.21±1.52)和糖尿病性ED组(4.79±0.56),糖尿病性ED组和对照+ET-1组(5.04±0.64)低于对照组(P＜0.01);糖尿病性ED+ ET-1组OPN mRNA表达水平(6.97±0.74)高于对照组(1.22±0.21)和糖尿病ED组(5.35±0.62),糖尿病性ED组和对照+ET-1组(4.98±0.46)高于对照组(P＜0.01).结论 ET-1不仅对收缩型CCMS有促表型转化作用,对合成型CCMS也有促表型转化作用,且ET-1对CCSM的作用是不可逆的.
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小鼠子宫平滑肌中h1calponin、ERK1/2在不同妊娠阶段及临产时的表达与意义
目的:探讨h1 CaP(h1 calponin,碱性调宁蛋白)及ERK1/2(external signal regulated kinase1/2,细胞外信号调节激酶1/2)在妊娠小鼠子宫平滑肌细胞中总蛋白和磷酸化蛋白的表达变化及与分娩的关系.方法:按妊娠阶段的不同,将小鼠分为未孕组、孕7天组、孕12天组、孕17天组、孕18天组、孕19天组、产时组.应用Western blot检测子宫平滑肌中h1 CaP、磷酸化h1 CaP(ph1 CaP)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p ERK1/2)的蛋白表达.结果:产时组h1 CaP蛋白表达显著高于未孕、孕7天、孕12天、孕17天组(P＜0.01),与孕18天、孕19天组比较差异无统计学意义(P＞0.05);ERK1总蛋白表达量产时组与其他各组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；ERK2总蛋白表达量产时组与其他各组比较差异无统计学意义(P＞0.05).ph1 Cap/h1 CaP的比值为产时组显著高于未孕组、孕7天、孕12天、孕17天、孕18天、孕19天组(P＜0.01),；pERK1/ERK1的比值产时组与其他各组比较差异无统计学意义(P＞0.05); pERK2/ERK2的比值产时组显著高于未孕组、孕7天、孕12天、孕17天、孕18天、孕19天组(P＜0.01).结论:子宫平滑肌细胞中h1 CaP蛋白表达在临产前达高峰,ph1 CaP及p ERK2水平在临产时达高峰.h1 CaP可通过促进ERK2磷酸化参与分娩发动;h1 CaP对分娩发动的影响不通过ERK1途径.
关键词： 碱性调宁蛋白 细胞外信号调节激酶1/2 分娩启动 子宫平滑肌 -
大鼠系膜细胞中碱性调宁蛋白h1和转化生长因子β1的表达及其相互关系
目的探讨大鼠系膜细胞(MsC)中碱性调宁蛋白(calponin)h1与TGF-β1的表达及其相互关系.方法制备大鼠抗thy-1系膜增生性肾炎模型(ATG).应用免疫组织化学ABC法、Western印迹、RT-PCR等方法分别从蛋白和核酸水平检测calponin h1和TGF-β1在肾炎模型第1、3、5、7、14、21、28天组织中的表达;采用细胞免疫化学和细胞免疫荧光法检测培养大鼠MsC中calponin h1的表达;应用Western印迹和RT-PCR的方法观察精氨酸和乙醇分别孵育后大鼠MsC中calponin h1和TGF-β1的表达变化.结果与少量表达calponin h1和不表达TGF-β1的正常组比,肾炎3 d组至14 d组calponin h1表达明显增强,7 d组至28 d组TGF-β1表达显著增强(P＜0.05).calponin h1表达定位于大鼠MsC胞浆内.精氨酸作用后大鼠MsC TGF-β1表达增强,calponin h1表达减弱;乙醇作用后大鼠MsC表达calponin h1升高,表达TGF-β1降低.结论ATG大鼠MsC中calponin h1表达在肾小球病变早期增强,后期减弱;而TGF-β1表达则在肾小球病变中晚期显著增强.calponin h1可能具有负反馈调节TGF-β1表达的作用.
关键词： 转化生长因子β1 系膜细胞 碱性调宁蛋白 抗Thy-1肾小球肾炎 -
高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化
目的 探讨高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌是否存在表型转化及对勃起功能的影响.方法 16周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)及其同系正常血压大鼠(WKY),测量尾动脉收缩压,颈部皮下注射阿朴吗啡后检测阴茎勃起功能,然后将大鼠分为高血压勃起功能障碍组(HBP&ED)、高血压组(HBP)和正常对照组(Control).免疫组化染色和彩色图文分析系统分析各组大鼠阴茎海绵体中平滑肌细胞碱性调宁蛋白(calponin 1)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,实时荧光定量RT-PCR分析各组大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞calponin 1 mRNA和OPN mRNA的相对表达量.结果 在大鼠阴茎海绵体中calponin 1和calponin 1 mRNA表达情况:HBP&ED组低于HBP组(P=0.021,P=0.006)和control组(P=0.000,P=0.001),HBP组低于control组(P=0.000,P=0.015);OPN和OPN mRNA表达情况:HBP&ED组高于HBP组(P=0.000,P=0.000)及control组(P=0.000,P=0.000),HBP组高于control组(PP=0.013,p=0.000).结论 高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞存在表型由收缩型向合成型转化,这种转化达到一定程度终可能导致大鼠勃起功能障碍.
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碱性调宁蛋白在系统性硬化症中的表达及作用
目的 研究碱性调宁蛋白(CNN1)在系统性硬化症(SSc)中的表达及其对成纤维细胞的作用.方法 收集SSc患者皮肤活检组织19例,正常人的皮肤活检组织21例.通过Real-time PCR方法检测皮肤组织中CNN1和α-SMA的基因表达;通过免疫组化方法检测皮肤组织中CNN1的蛋白表达;利用RNA干扰方法降低成纤维细胞中CNN1的基因表达,通过Real-time PCR检测细胞中CNN1及纤维化相关基因α-SMA、CTGF、COL1A1、COL1A2、COL3A1的mRNA相对表达量;应用细胞实时增殖检测系统(xCELLigence系统)检测细胞增殖.结果 与正常对照相比,SSc患者皮肤组织中CNN1的表达水平显著升高(P<0.05);皮肤组织中,CNN1的表达和α-SMA存在正相关,具有统计学意义(r=0.7219,P<0.0001);与正常对照组相比,SSc患者皮肤组织中CNN1的蛋白表达升高;原代皮肤成纤维细胞中,CNN1的表达和α-SMA、COL1A1均存在正相关,具有统计学意义(r=0.6547,P<0.05;r=0.6438,P<0.05);同时,原代皮肤成纤维细胞中干扰CNN1后,可显著抑制细胞增殖,降低纤维化相关基因(CTGF、COL1A2等)表达,降低胶原蛋白的表达.结论 CNN1在SSc患者中表达升高,且干扰CNN1可降低成纤维细胞活性,提示CNN1与SSc纤维化密切相关.
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PKC-ε、hi calponin在不同孕期小鼠子宫平滑肌中的表达及意义
目的 探讨蛋白激酶C epsilon( protein kinaseC epsilon,PKC-ε)及碱性调宁蛋白(h1 calponin,h1 CaP)在妊娠小鼠子宫平滑肌细胞中总蛋白和磷酸化蛋白的时空表达变化及与足月临产、早产的关系和机制.方法 建立小鼠酒精灌胃早产模型.按妊娠阶段的不同,将小鼠分为未孕组、早孕组(孕7 d)、中孕组(孕12 d)、晚孕组(孕18 d)、足月产组和早产组,每组各10例.应用Western blot检测子宫平滑肌中PKC-ε、磷酸化PKC-ε (pPKC-e)、h1 CaP、磷酸化h1 CaP( ph1 CaP)的蛋白表达.结果 足月产组和早产组PKC-ε蛋白表达均显著高于未孕、早孕、中孕组(P＜0.01),晚孕组、足月产组、早产组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)；足月产组和早产组h1 CaP蛋白表达均显著高于未孕、早孕、中孕组(P＜0.01),晚孕组、足月产组、早产组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；足月产组和早产组pPKC-ε/PKC-ε值均显著高于未孕、早孕、中孕组及晚孕组(P＜0.01),足月产组与早产组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)；足月产组和早产组ph1CaP/h1 CaP值均显著高于未孕、早孕、中孕组及晚孕组(P＜0.01),足月产组与早产组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)；pPKC-e/PKC-ε的变化与ph1 CaP/h1 CaP的变化呈正相关(r=0.73,P＜0.05).结论 PKC-ε及h1 CaP蛋白表达在临产前即达到高峰,pPKC-ε及ph1 caP水平在临产时达高峰.PKC-ε可通过激活h1 CaP参与足月产及早产的分娩发动.
关键词： 蛋白激酶C epsilon 碱性调宁蛋白 分娩启动 早产 子宫平滑肌
