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LC促进人成骨样MG-63细胞增殖及相关机制的研究
目的 探讨大黄酸哌嗪雌酚酮(rhein-piperizinyl-estrone,LC)对人成骨样MG-63细胞增殖活性的影响及其相关分子机制.方法 在原工作基础上,以兼有两种雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型表达的人成骨样MG-63细胞为研究对象,分别应用MTT法和流式细胞术,观察LC对MG-63细胞的增殖活性和细胞周期分布的影响.利用前期构建的ERα或ERβ稳定高抑制表达的MG-63细胞株,应用免疫印迹技术,对LC的作用机制和可能的信号通路进行研究.结果 与对照组相比,LC可明显促进MG-63细胞的增殖活性,该作用具有剂量依赖性;可调节细胞周期分布,使G1期细胞比例减少、G2 +S期细胞比例增加,进而促进细胞生长.进一步研究发现,ER阻断剂ICI 182,780可完全阻断LC的促增殖作用,提示LC是经ER途径对MG-63的增殖活性发挥作用的;利用ERα或ERβ高抑制表达的稳定细胞株,证实LC的促增殖作用是由ERα和ERβ共同介导的;该作用与Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt信号通路的激活密切相关.结论 LC可经ERα和ERβ共同介导对人成骨细胞的促增殖作用,有望成为治疗绝经后骨质疏松症的新型骨靶向雌激素类药物.
关键词： 大黄酸哌嗪雌酚酮(LC) 人成骨细胞 MG-63 增殖 雌激素受体 -
淫羊藿苷对人成骨样细胞成骨分化及OPG/RANKL表达的影响
目的 探讨淫羊藿苷对人成骨样细胞(MG-63)成骨分化及OPG/RANKL表达的影响.方法 用1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L 5种浓度的淫羊藿苷对MG-63进行干预,并同时进行成骨诱导,RT-PCR在第3天检测其细胞增殖基因MYC、CDK7表达量,在第6天检测成骨分化标志基因RUNX2、COL1A1及OPG、RANKL的表达量.结果 对成骨分化相关基因,10 nmol、1μmol干预的MG-63 RUNX2基因表达量较1 nmol及10μmol的高(P＜0.05),与100 nmol及空白对照组没有明显差别(P＞0.05),10μmol的RUNX2蛋白表达量较其余各组更高;COLIA1的基因表达呈剂量依赖型,随浓度的增加而升高,10μmol的表达量较其余各组有明显升高(P＜0.05),其蛋白表达也更多;RANKL的表达量极低,且在各组之间均无明显差异(P＞0.05);OPG的表达在lμmol浓度时较100 nmol、10μmol明显增高(P＜0.05),与1 nmol、10 nmol及空白组没有统计学差异(P＞0.05);与细胞增殖相关的MYC的表达各组之间均没有差异(P＞0.05),而CDK7的表达均较空白组降低(P＜0.05).结论 10μmol/L的淫羊藿苷能够明显促进MG-63细胞的成骨分化,但并不通过影响OPG/RANKL起效.
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流体剪切应力对人骨肉瘤MG-63细胞周期相关基因表达的影响
目的 观察入骨肉瘤MG-63细胞在流体剪切应力作用后,MG-63细胞中细胞周期相关基因表达谱的变化特点.方法 MG-63细胞常规培养72 h,随机分成剪切应力作用组和无剪切应力作用对照组.将剪切应力作用组的细胞载玻片置于流体剪切系统中进行实验,流体剪切应力设为1.5 Pa,作用时间为60 min.无剪切应力作用组的细胞静置相同时间.之后分别提取两组的RNA,用Affymetrix公司的全人类基因组芯片进行杂交,并对获得的数据进行分析.结果 MG-63细胞中细胞周期相关基因表达谱发生改变,247个与细胞周期相关的基因出现差异表达,130个基因表达上调(Fold Change＞2,P＜0.05),117个基因表达下调(Fold Change＜-2,P＜0.05).差异基因主要参与细胞周期多个生物学过程的调控,包括对细胞周期进程、周期阻滞、有丝分裂调控、G1/S转变、有丝分裂间期等生物学过程的调控.结论 流体剪切应力可以通过改变成骨细胞中细胞周期相关基因的表达,进而调控成骨细胞的增殖和分化等功能.
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斑蝥酸钠维生素B6对人成骨肉瘤细胞凋亡及存活素表达的影响
目的 研究斑蝥酸钠维生素B6诱导MG-63细胞凋亡的作用机制.方法 应用不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6作用于MG-63细胞,用MTT比色法检测药物对细胞的增殖抑制作用;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测存活素信使核糖核酸的表达.结果 斑蝥酸钠维生素B6在抑制MG-63细胞增殖方面有显著作用,其作用具有时间和剂量依赖性,抑制率可高达(68.56±5.21)％.RT-PCR显示可下调survivin基因表达.结论 斑蝥酸钠维生素B6抑制MG-63细胞增殖效果明显,其机制可能与下调survivin基因的表达有关.
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人骨肉瘤细胞株MG-63中肿瘤干细胞的生物学特性
背景:骨肉瘤干细胞在骨肉瘤的发生、复发及对化疗药物的耐药性中发挥关键作用,而目前关于骨肉瘤干细胞体外分离培养及生物学特性研究的报道甚少.目的:从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出具有干细胞特征的高致瘤性细胞亚群,检测肿瘤干细胞特异性标志物CD105的表达.方法:无血清悬浮培养法从人骨肉瘤细胞株MG-63中分离出骨肉瘤细胞球,应用流式细胞术检测细胞球中CD73、CD90、CD105的表达,免疫荧光法检测骨肉瘤细胞株及骨肉瘤细胞球中CD105的阳性率,免疫磁珠法分选出CD105+和CD 105的细胞,传代后分别接种于NOD/SCID小鼠评估其致瘤性.结果与结论:CD105在球体细胞中高表达,此类肿瘤细胞具有高侵袭性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中仅需移植1 000个细胞即可形成肿瘤,这些细胞具有自主生长特性,能够在无血清条件下长期培养,CD105+骨肉瘤细胞显示了干细胞的生物学特性,CD105可能成为骨肉瘤干细胞的表面标志之一.
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二膦酸盐与顺铂对体外MG-63细胞株生长影响的比较
背景：有研究表明二膦酸盐可以作用于骨肉瘤细胞，但是其作用效果与传统的一线化疗药物顺铂的效果对比分析目前报道较少。目的：分析二膦酸盐对体外人骨肉瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用与顺铂的差异。方法：对MG-63细胞株培养传代后，分别以不同质量浓度二膦酸盐、顺铂干预细胞，并设未干预组为阴性对照组，通过MTT法测定二膦酸盐及顺铂作用后人骨肉瘤细胞的抑制率，并通过荧光染色观察细胞形态。结果与结论：不同质量浓度的二膦酸盐及顺铂处理 MG-63细胞不同时间后，细胞生长抑制率与空白组(无药物干预)对照明显升高(P <0.05)。分析发现两者在24，48，72 h率的差异无显著性意义(P >0.05)。认为二膦酸盐对体外骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，其抑制作用与顺铂相似。
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不同方式的低能量激光照射对MG-63细胞周期和细胞凋亡的影响
目的 探讨不同方式的低能量激光照射(LLLI)对MG-63细胞周期和细胞凋亡的影响.方法 将对数生长期的人成骨样细胞MG-63随机设为3组,采用Ga-Al-As半导体激光器(808 nm,66 mW)进行照射.照射Ⅰ组照射3 d,每天照射剂量1.25 J/cm~2;照射Ⅱ组照射1 d,照射剂量3.75 J/cm~2;两组的照射总剂量均为3.75 J/cm~2;对照组不进行激光照射.照射后72 h,采用流式细胞术分别检测各组的细胞周期和细胞凋亡率.结果 与对照组相比,照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的S期细胞数增加,G_1期细胞数减少,细胞增殖指数增加(P＜0.05),且两个照射组之间无明显差异(P＞0.05).与对照组相比,照射Ⅰ组和照射Ⅱ组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),且两个照射组之间无明显差异(P＞0.05) .结论 总剂量为3.75 J/cm~2的LLLI可以通过改变细胞周期时相促进细胞增殖,并能抑制细胞凋亡.在相同的照射剂量下,多次照射和单次照射无明显差别.
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牵张应力对成骨肉瘤细胞MG-63中RhoA和ROCK表达的影响
目的:探索机械牵张应力对人成骨肉瘤细胞MG-63中RhoA/ROCK信号通路的影响.方法:将同一条件培养的细胞MG-63分为实验组(加力)与对照组(不加力),实验组采用Flexcell牵张应力加载系统,选择12％形变率作为加栽应力值,分为五个时间组,分别加载lh,4h,8h,12h,24h,RT-PCR检测RhoA、ROCKmRNA水平表达的变化,Westem-Blot检测RhoA与Rock蛋白含量变化.结果:RT-PCR显示MG-63细胞受应力刺激后1 hRhoA、ROCK均未见明显变化(P＞o.05),4小时后略有升高(P＜0.05),在8h达到大值(P＜0.05),12、24h降低,但仍高于对照组(P＜0.05);Western-Blot显示MG-63细胞受应力刺激后1 hRhoA、ROCK均未见明显变化,4h仍未见明显变化,在8h达到大值,12、24h降低,高于对照组.结论:机械牵张力加栽下MG-63细胞内RhoA、ROCK表达升高并随时间增加出现峰值,提示其可能在成骨细胞力学信号转导过程中发挥重要作用.
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miR-129通过靶向SEPHS1对骨肉瘤细胞MG-63增殖及凋亡的影响
目的 探讨miR-129对骨肉瘤细胞系MG-63细胞活性及凋亡的影响.方法 收集30例骨肉瘤组织及其配对的癌旁组织,应用实时荧光定量法(RT-PCR)检测miR-129 miRNA和SEPHS1的mRNA的表达水平,应用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测SEPHS1蛋白的表达水平.在体外培养的MG-63细胞中过表达或敲低miR-129,通过CCK-8检测细胞增殖情况,检测miR-129对MG-63细胞增殖能力的影响.同时应用Western blot和Hoechest染色检测MG-63的凋亡情况.结果 在本研究中,我们发现miR-129在骨肉瘤组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.05).通过建立miR-129过表达或敲低的体外模型,确定miR-129模拟物和抑制物浓度为50 nM和200 nM时过表达和敲低的效果佳.通过软件预测miR-129和SEPHS1具有结合的可能,荧光素酶报告基因试验进一步确定了miR-129和SEPHS1的结合关系.通过Western blot和Hoechest试验,发现敲低miR-129可以显著抑制MG-63的活性,加速MG-63的凋亡.结论 miR-129可能通过与SEPHS1结合,在调节骨肉瘤细胞增殖和凋亡进程中起关键作用.
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不同方式的低能量激光照射对MG-63矿化组织特异性蛋白的mRNA表达的影响及意义
目的 观察不同方式的低能量激光照射(low level laser irradiation,LLLI)对MG-63矿化组织特异性蛋白的mRNA表达的影响及意义.方法 将对数生长期的人成骨样细胞MG63随机分为3组,采用Ga-Al-As半导体激光器(808 nm,66 mW)进行照射,照射组1为照射3天,每天照射剂量为1.25 J/cm~2,照射组2为照射1天,照射剂量为3.75 J/cm~2,两组的照射总剂量均为3.75 J/cm~2;对照组不进行激光照射.照射后72 h,利用半定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)的方法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN),I型胶原蛋白(collagen I,Coll I)的mRNA的表达量.结果 照射组1和照射组2的OPN, Coll I的mRNA的表达量均明显高于对照组,有显著性差异(P<0.05);照射组1和照射组2之间没有显著性差异(P>0.05).结论 总剂量为3.75 J/cm~2的低能量激光照射可以促进MG-63表达矿化组织特异性蛋白OPN和Coll I,可能促进成骨.在相同的照射剂量下,多次照射和单次照射没有明显区别.
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MTT法测定注射用鹿瓜多肽活性
目的:建立注射用鹿瓜多肽的活性测定方法.方法:采用人成骨肉瘤细胞MG-63,MTT法测定注射用鹿瓜多肽活性.结果:样品刺激指数大于2.1,注射用鹿瓜多肽对MG-63细胞具有增殖作用.结论:MTT法测定注射用鹿瓜多肽活性,方法可行、稳定.
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siRNA沉默COX-2基因对骨肉瘤MG-63细胞凋亡和自噬的影响
目的:探讨小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)抑制环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因的表达对骨肉瘤MG-63细胞凋亡和自噬的影响及其可能的机制.方法:将靶向COX-2基因的siRNA(COX-2siRNA)转染至骨肉瘤MG-63细胞后,FCM法检测其对细胞凋亡的影响,实时荧光定量PCR法检测细胞中COX-2、Bcl-2、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和Beclin 1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测COX-2、Bcl-2和Beclin 1蛋白的表达.结果:COX-2 siRNA转染组MG-63细胞中COX-2mRNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(转染control siRNA)和空白对照组(未转染的MG-63细胞)(P＜0.05).COX-2 siRNA转染组MG-63细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).COX-2siRNA转染组MG-63细胞中抗凋亡因子Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平下调(P＜0.05),自噬相关因子LC3和Beclin 1 mRNA及Beclin 1蛋白的表达水平上调(P＜0.05).结论:沉默COX-2基因可以促进骨肉瘤MG-63细胞的凋亡和自噬.
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活细胞实时成像技术研究抗坏血酸(AA)协同砷剂抗人骨肉瘤MG-63的体外疗效
目的 研究抗坏血酸(ascorbic acid,AA)和三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)抗人骨肉瘤细胞MG-63的体外疗效.方法 以MG-63细胞为体外模型,用62.5 μmol/L AA与1μmol/L As2O3单独或联合处理细胞,利用新型连续活细胞图像采集和分析平台(continuous live cell imaging and analysis platform,Cell IQ)实时观察细胞的生长情况和形态学的变化.结果 1 μmol/L As2O3和62.5 μmol/L AA单独处理都可抑制MG-63细胞的生长并诱导细胞死亡.1 μmol/L As2O3和62.5 μmol/L AA联合处理细胞较单独处理组细胞抑制效果更明显.结论 AA和AS2O3抗人骨肉瘤细胞Mg-63可起到协同作用,这一结果为临床治疗骨肉瘤提供了新的思路和实验依据.
关键词： 三氧化二砷(As2O3) 抗坏血酸(AA) MG-63 骨肉瘤 细胞凋亡 -
β-榄香烯通过抑制WNT信号通路促进MG-63细胞凋亡
β-榄香烯在作为化疗药使用时表现为互副作用小,极少产生耐药性[1].但是榄香烯治疗骨肉瘤尚未见报道.
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miRNA-137在骨肉瘤中的作用及机制研究
[目的]通过转染miRNA-137至人骨肉瘤细胞MG-63,观察细胞内TWIST蛋白含量变化及其对细胞增殖活性的影响以探讨miRNA-137在骨肉瘤中的作用及机制.[方法]TargetScan预测miRNA-137与TWIST结合靶位;PCR扩增TWIST基因3'UTR区并克隆至荧光素酶报告基因表达载体;化学法合成miRNA-137 mimics,miRNA-137 inhibitor及NC序列,与荧光素酶报告基因表达载体共转染293细胞,48 h后检测荧光素酶活性;转染miRNA-137至MG-63细胞,转染后48 h,Real Time-PCR检测转染后细胞内miRNA-137含量,Western-blot检测细胞中TWIST蛋白含量变化;转染后0～72 h,CCK-8检测肿瘤细胞增殖活性.[结果]证实了miRNA-137与其靶基因TWIST的结合位点;miRNA-137 mimics转染MG-63细胞,可明显抑制细胞内TWIST蛋白表达,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而miRNA-137 inhibitor转染细胞后可明显增强胞内TWIST蛋白的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05));miRNA-137 mimics可明显抑制MG-63细胞对数期增殖活性,而miRNA-137 in-hibitor则使细胞增殖活性进一步增强,相同时间点与对照相比较,均有差异(P＜0.05).[结论]miRNA-137可以通过抑制其靶基因TWIST表达来抑制MG-63细胞增殖活性.
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机械张应力与雌激素对成骨样细胞株MG-63增殖活性的影响
目的 探讨雌激素与机械张应力对成骨样细胞株(MG-63)增殖活性的影响.方法 体外培养成骨样细胞株MG-63,利用四点弯曲细胞力学加载装置对细胞进行加力,或在培养基中加入不同浓度的雌激素,采用MTT方法测定雌激素与机械张应力对MG-63细胞增殖活性的影响.结果 10-10～10-8 mol/L的雌激素可以促进细胞生长,但是浓度大于10-9 mol/L时,细胞的增殖活性受到抑制.机械张应力对于MG-63细胞的增殖起到负调节作用,1 000 μstrains与2 000 μstrains的应力作用后,对细胞增殖活性的影响无统计学差异(P>0.05).结论 机械张应力和雌激素均可对MG-63细胞的增殖活性产生影响.
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Ras相关区域家族1基因启动子去甲基化对骨肉瘤细胞生物学行为的影响
目的 检测MG-63骨肉瘤细胞Ras相关区域家族1(RASSF1)基因启动子甲基化,并观察5-氮杂胞苷去甲基化对其生物学行为的影响.方法 采用亚硫酸盐测序法(BSP)检测MG-63骨肉瘤细胞RASSF1基因启动子甲基化状态,比较5-氮杂胞苷处理前后RASSF1甲基化状态、基因表达、细胞增殖曲线、细胞周期和凋亡的差异.结果 5-氮杂胞苷处理前RASSF1基因启动子第1～3、第16 CG位点甲基化率为40.0％,第4～15 CG位点甲基化率为60.0％;处理后的MG-63骨肉瘤细胞RASSF1基因启动子第1～16 CG位点甲基化率为0.正常未处理MG-63骨肉瘤细胞RASSF1基因mRNA和蛋白质表达处于低表达状态,5-氮杂胞苷处理后RASSF1基因mRNA和蛋白质表达显著增加,显著高于处理前.5-氮杂胞苷处理后的细胞增殖速度减慢,D1-D8细胞吸光度值显著低于正常未处理的细胞.5-氮杂胞苷处理后的MG-63骨肉瘤细胞Go/G1期和凋亡率显著高于处理前细胞(P＜0.05),S期、G2/M期和增殖指数(PI)显著低于处理前细胞(P＜0.05).结论 MG-63骨肉瘤细胞RASSF1基因启动子处于甲基化和表达抑制状态,5-氮杂胞苷能逆转RASSF1基因启动子甲基化状态,使基因重新表达而抑制细胞增殖并促进其凋亡.
关键词： 骨肉瘤 MG-63 Ras相关区域家族1 甲基化 生物学行为 -
参麦注射液体外诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的机制研究
目的:研究参麦注射液体外对骨肉瘤MG-63细胞生长的影响及作用机制.方法:体外培养MG-63细胞,以不同浓度的参麦注射液作用于细胞,MTT法检测肿瘤细胞生长抑制率;流式细胞术测细胞凋亡率和细胞周期;ELISA法测凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的含量;Bradford法测SOD、MDA含量.结果:参麦注射液能显著抑制MG-63细胞的增殖,呈剂量依赖性;增加MG-63细胞的凋亡率,并诱导出现S细胞周期阻滞;作用MG-63细胞后,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量增加;升高细胞内SOD的活性,降低MDA的含量.结论:参麦注射液抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖的作用机制与诱导细胞凋亡和将细胞周期阻滞于S期有关,其诱导凋亡的机制与Caspase家族,以及增加机体的抗氧化功能有关.
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17β-雌二醇对人骨肉瘤MG-63细胞株IL-6、IL-11和NF-κB表达的作用
目的观察17 β-雌二醇(17 β-E2)对人骨肉瘤(Osteosarcoma)MG-63细胞株IL-6(interleukin-6)、IL-11及NF-κ B(nuclear factor-kappa B)表达的影响.方法用RT-PCR技术、Northern blot和Western Blot观察17β-E2对人骨肉瘤MG-63细胞株IL-6、IL-11及NF-κB表达的影响.结果17β-E2下调MG-63细胞IL-6 mRNA及蛋白质的表达;17 β-E2下调MG-63细胞IL-11mRNA及NF-κB蛋白质的表达.结论17 β-E2下调MG-63细胞NF-κ B、IL-6和IL-11的表达,此可能是妇女绝经后雌激素补充治疗的依据之一.
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分化抑制因子Id1对骨肉瘤细胞增殖的影响
目的 探讨分化抑制因子Id1对骨肉瘤细胞增殖的影响及可能的途径.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Id1表达调节后MG-63细胞增殖变化情况;采用流式细胞术检测Id1下调表达后,MG-63细胞凋亡及细胞周期变化情况;Western blotting技术检测Id1下调表达后对p-AKT水平的影响.结果 本实验利用RNA干扰技术下调骨肉瘤细胞系Id1表达后,可以明显抑制MG-63细胞的增殖,p-AKT的水平也显示下降,流式细胞术证明下调后Id1的水平可以一定程度地调节细胞凋亡水平,而对细胞周期无明显影响,另外进一步构建了Id1的真核表达质粒,转染Id1过表达质粒后,并未见骨肉瘤细胞明显地增殖加速.结论 分化抑制因子Id1可能通过影响AKT信号通路进而影响了骨肉瘤细胞的增殖.
