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PIWIL2蛋白在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及临床意义
目的 研究PIWIL2在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及其与临床病理特征和根治性切除术预后的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测41例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中PIWIL2的表达;蛋白印迹和细胞免疫荧光技术检测人胆管癌细胞系QBC939和人正常胆管上皮细胞HIBEpic株中PIWIL2的表达.采用Kaplan-Meier法对胆管癌根治术后患者进行生存期的单因素及多因素分析.结果 PIWIL2在肝门部胆管癌和QBC939细胞中的表达明显高于对照组织和HIBEpic细胞(P＜0.05);PIWIL2在低、中分化胆管腺癌的表达明显高于高分化腺癌(P＜0.05).单因素生存分析显示根治术后PIWIL2高表达的生存期较短(P＜0.05).多因素分析显示PIWIL2的表达水平是影响胆管癌根治术预后的独立危险因素(P＜0.05).结论 PIWIL2在肝门部胆管癌组织和细胞系中表达上调,其表达水平与肿瘤分期及分化程度相关,是影响肝门部胆管癌根治切除预后的独立危险因素.
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PIWIL2在人类膀胱尿路上皮癌中的表达及其功能研究
目的 研究PIWIL2在人类膀胱尿路上皮癌(BTCC)中的表达及siRNA对人类膀胱癌细胞PIWIL2表达的影响.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BTCC 46例、腺性膀胱炎21例、癌旁组织17例、正常膀胱组织14例中PIWIL2mRNA的表达；设计合成针对PIWIL2的3个特异性siRNA,转入人类膀胱癌BIU-87细胞,分别采用四甲基偶氮唑蓝、DNA原位末端标记法、RT-PCR和Western blot检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率(IR)、凋亡指数(AI)和PIWIL2 mRNA及其蛋白表达的影响.结果 BTCC组织中PIWIL2 mRNA的表达率为76.08％(35/40),均显著高于腺性膀胱炎组织[42.86 ％(9/21)]、癌旁组织[41.17％(7/17)]和正常膀胱组织[7.14％(1/14)] (P=0.008,P=0.010,P=0.000).BTCC组织中PIWIL2的高表达与肿瘤淋巴结转移、病理分级均密切相关.siRNA1 ～3组细胞的IR[( 37.52±8.84)％、(64.36±9.64)％、(62.94±8.43)％]和AI[(26.18±5.42)％、(38.75±6.19)％、(40.02±5.64)％]均分别显著高于对照组[(1.97±0.02)％、(3.35±0.47)％](均P=0.000),PIWIL2mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组；其中siRNA 2、3组细胞的IR、AI和对PIWIL2表达的抑制作用均显著高于siRNA 1组.结论 PIWIL2在BTCC中的高表达,提示其与膀胱癌的发生、发展密切相关；体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞PIWIL2的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞生长,提示PIWIL2可作为膀胱肿瘤基因治疗的重要靶点.
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环磷酰胺暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤移植瘤中的表达
目的 探讨环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)移植瘤中的表达.方法 建立免疫活性C57BL/6j系小鼠的人NB SK-N-SH细胞株荷瘤模型,选择瘤体积在100 ～ 200mm3之间的20只荷瘤小鼠,随机分为生理盐水对照组(NS组)和环磷酰胺组(CP组),每组10只,CP组每日经腹腔注射CP75 mg/kg,2次/周,连续2周;NS组每日经腹腔注射NS 2 ml.每2天测量肿瘤体积,计算相对肿瘤体积(RTV);停药后次日处死小鼠,称瘤重,计算抑瘤率(IR);并采用RT-PCR法检测各组移植瘤组织中Piwil2基因mRNA的转录水平,免疫组化法和Western blot法检测各组移植瘤组织中Piwil2蛋白的分布及表达水平.结果 与NS组比较,CP组移植瘤的RTV和瘤重均显著降低(P＜0.05),CP组的平均抑瘤率为83.56％.两组移植瘤组织中Piwil2基因mRNA的转录水平差异无统计学意义(P＞0.05).NS组移植瘤组织中Piwil2蛋白高表达于胞浆,而CP组大部分肿瘤细胞坏死,Piwil2蛋白表达下降,细胞核稀疏,核浓缩,细胞体积变小;CP组移植瘤组织中Piwil2蛋白的表达水平明显低于NS组(P＜0.05).结论 CP干预后,移植瘤缩小,移植瘤组织中Piwil2基因mRNA的转录水平不变,但蛋白表达水平有改变,可能影响人NB抵抗性.
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Piwil2调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制探讨
背景与目的:Piwil2在肿瘤干细胞及癌前干细胞中高表达,通过转录和转录后调控机制调控多种基因表达,与肿瘤发生、发展密切相关.该研究探讨Piwil2与宫颈癌细胞恶性生物学行为之间的关系及可能的调控机制.方法:构建慢病毒载体pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP和shPiwil2质粒,分别转染HeLa和SiHa细胞,建立过表达/沉默Piwil2表达稳转细胞株,反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定转染效果;采用CCK-8法检测细胞增殖能力;PI染色后,流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)检测细胞周期;Western blot检测细胞增殖及周期相关调控蛋白表达;采用维拉帕米(verapamil)处理细胞,Hoechst 33342染色,FACS检测侧群(side polulation,SP)细胞比例;CCK-8法检测顺铂对细胞的杀伤活性.结果:过表达Piwil2上调HeLa和SiHa细胞S期及G2/M期细胞比例,进而促进细胞增殖,与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);沉默Piwil2表达则细胞发生G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖(P<0.05);Piwil2上调cyclin D1表达,提高Stat3磷酸化水平,下调p53表达;Piwil2显著上调HeLa和SiHa细胞中SP细胞比例(P<0.01),提高宫颈癌细胞对顺铂的耐药性(P<0.01);沉默Piwil2则相反,显著提高对顺铂的敏感性.结论:Piwil2上调SP细胞比例,促进宫颈癌进展;Piwil2可作为宫颈癌的潜在治疗靶点.
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沉默 Piwil2表达对子宫颈癌细胞增殖和衰老的影响
目的：采用 shRNA 沉默 Piwil2基因的表达，探讨其对宫颈癌细胞株增殖和衰老特性的影响。方法通过脂质体 Lipofectamine2000转染技术和嘌呤霉素筛选，建立稳转Sh-piwil2宫颈癌细胞株，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和 Western blot 法验证沉默效果。采用细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期和细胞衰老等实验观察沉默 Piwil2表达对宫颈癌细胞生物学特性的影响。结果建立稳定转染 Sh-piwil2宫颈癌细胞株，与对照组相比，沉默Piwil2表达后细胞的增殖和集落形成能力均显著降低(P <0．05)；细胞 G0/ G1期比例增加、S 期比例明显下降( P <0．05)，同时沉默 Piwil2后细胞衰老数量明显增多( P <0．05)。结论沉默 Piwil2基因可发挥抗宫颈癌作用，推测Piwil2基因可作为宫颈癌临床治疗的一个潜在靶点。
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Piwil2与肿瘤的关系及研究进展
Piwil2属于Argonaute蛋白家族的PIWI亚家族,在人类中目前已发现,Argonaute蛋白家族的两个亚族:一类为类似植物拟南芥Argonaute1的AGO亚族,主要为AGO1、AGO2、AGO3、AGO44个亚型:另一类为类似果蝇中Piwi的PIWI亚族,主要为Piwil1 (HIWI)、Piwil2 (HILI)、Piwil 3、Piwil 4(HIWIL2)4个亚型[1].其中PIWI家族包括PAZ和piwi两个结构域,是RNA诱导沉默复合体的主要组成部分,在干细胞的自我更新、胚子形成发育、RNA沉默及转录调控中起到重要作用.
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肿瘤抗原 PIWIL2的 HLA-A2限制性 CTL 表位鉴定
目的：鉴定肿瘤抗原PIWIL2的人类白细胞抗原A2（HLA-A2）限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位。方法：首先运用RT-PCR、Western blot方法检测PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中的表达情况，然后通过BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1.2及IEDB软件预测打分来选取PIWIL2的HLA-A2限制性的表位。候选表位肽通过标准的Fmoc化学合成法合成，结合力实验用于检测候选表位与T2A2细胞表面HLA-A2分子的结合能力，ELISPOT实验检测候选表位肽诱导CTL分泌IFN-γ的能力，体外细胞毒性实验检测候选肽诱导CTL的能力。结果：PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中均有表达。候选肽P485、P493、P965具有中等结合力。 ELISPOT实验结果显示表位肽P485和P965诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力。细胞毒性实验结果显示表位肽P485和P965对MCF-7细胞均有一定的杀伤作用。结论：表位肽P485和P965是优秀的PIWIL2抗原HLA-A2限制性CTL候选表位，可能成为新的抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位。
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Piwil2重编程人成纤维细胞形成肿瘤干细胞的初步研究
目的 初步观察精原干细胞自我更新基因Piwil2重编程人成纤维细胞的细胞形态及功能特征变化,建立Piwil2调控肿瘤干细胞发生过程的细胞实验模型.方法 将携带Piwil2-GFP标记和空载目的基因GFP标记的慢病毒载体分别感染原代培养的小儿包皮成纤维细胞,筛选建立稳定表达Piwil2-GFP和GFP成纤维细胞系,观察细胞形态变化及肿瘤球形成过程,分析细胞染色体核型,进行裸鼠体内成瘤实验,RT-PCR、免疫组织化学进一步鉴定重编程后细胞的干细胞特征及三胚层分化的相关标志物.结果 转染后第5天,Piwil2-GFP成纤维细胞开始由长梭形逐渐转变为圆形,第14天出现集落样生长状态,挑选集落重悬后培养形成类似“肿瘤球”样克隆,其细胞染色体核型呈超二倍体的异质性改变.“肿瘤球”样克隆裸鼠体内移植2周时100％形成肿瘤,肿瘤组织学及免疫组化鉴定为表达多种外胚层、中胚层及内胚层肿瘤标志物的恶性肿瘤,RT-PCR显示细胞及裸鼠肿瘤表达干细胞多能基因Oct-4、Nanog、Sox2,以及三胚层特征标志物.结论 Piwil2重编程人成纤维细胞后的细胞具有干细胞及多潜能分化特性,以及显著的肿瘤细胞异质特性.
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乳酸菌培养上清液下调Piwil2基因增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性
目的 探讨乳酸菌培养上清液(lactobacilli supernatants,LS)处理乳腺癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的影响及其机制.方法 采用CCK-8和Western blot检测不同浓度DDP(0、1、2、3、4、5 μg/mL)和LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和Piwil2基因表达的影响;瞬时转染Piwil2 siRNA沉默MDA-MB-231细胞中Piwil2基因表达,Westernblot检测其沉默效果,CCK-8检测Piwil2基因沉默后对MDA-MB-231细胞增殖的影响;2μg/mL DDP联合不同浓度LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)作用MDA-MB-231细胞,观察细胞增殖抑制效应和Piwil2蛋白表达的改变.结果 高浓度DDP(≥3μg/mL)可抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.05),而低浓度DDP(≤2 μg/mL)不能有效抑制细胞增殖;DDP以剂量依赖性方式上调Piwil2蛋白的表达;siRNA沉默Piwil2表达可恢复2μg/mL DDP对细胞增殖的抑制.与对照组(乳酸菌培养基,MRS)比较,LS以剂量依赖性方式下调Piwil2蛋白的表达,但并不影响细胞的增殖;与单用2μg/mLDDP比较,2μg/mL DDP联合20％ LS处理可显著下调Piwil2蛋白的表达并抑制细胞增殖(P＜0.05).结论三阴性乳腺癌细胞中Piwil2的高表达可导致细胞对顺铂敏感性的降低,乳酸菌培养上清液可通过下调PiwiL2基因的表达增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性.
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人膀胱癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及PIWIL2表达
目的 从人膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中分离培养肿瘤干细胞样细胞(CSLC),鉴定其生物学特性,并研究PIWIL2在 CSLC中的表达和意义.方法 收集12例不同临床分期BTCC患者组织标本,通过酶消化和原代培养相结合等方法处理,采用无血清悬浮培养法分离培养获得含CSLC的悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;采用半定量逆转录聚合酶链反应检测PIWIL2 mRNA在CSLC中的表达;裸鼠皮下接种CSLC,观察其成瘤能力.结果 成功地从人膀胱癌组织分离培养获得可悬浮生长、稳定传代的CSLC,CSLC高表达CD133和CD44,裸鼠皮下接种1×104、1×105个CSLC均可全部成瘤,PIWIL2 mRNA在CSLC的表达显著高于正常膀胱组织细胞.结论 采用无血清悬浮培养法成功从人膀胱癌组织中分离获得CSLC,具有肿瘤干细胞特性,能高度表达PIWIL2,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供了实验依据.
