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大鼠催乳素腺瘤MMQ细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养和鉴定
目的 探索大鼠垂体催乳素腺瘤MMQ细胞株中肿瘤干细胞样细胞的体外培养条件,并观察其增殖、分化及种植成瘤的特点.方法 采用含表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养液悬浮培养MMQ细胞,获得肿瘤干细胞样细胞球(简称细胞球),行克隆培养,观察其增殖能力;应用流式细胞技术测定CD133阳性细胞比例,Western blot试验测定细胞球CD133、巢蛋白(nestin)的表达,免疫荧光技术检测细胞球CD133、nestin、归巢细胞黏附分子(HCAM/CD44)、八聚体结合转录因子4(OCT4)、干细胞抗原1(SCA1)的表达,以及细胞球分化细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经微管蛋白([3-tublinⅢ)和S100蛋白的表达.取雌性裸鼠27只,随机分为细胞球种植组、MMQ细胞种植组和正常对照组,每组9只.皮下种植6周后,测量肿瘤体积及血清催乳素(PRL)水平,肿瘤组织切片行HE染色和免疫组化检测.结果 在无血清培养液悬浮培养条件下,仅少数细胞能存活并形成细胞球,吹散后细胞能克隆增殖成球,细胞球中CD133阳性细胞比例为(1.10±0.17)％.细胞球上CD133、nestin、HCAM/CD44、OCT4和SCA1呈阳性表达;细胞球分化后,细胞阳性表达GFAP、β-tublinⅢ和S100蛋白.细胞球种植组成瘤体积为(1262.2±279.1)mm3,MMQ细胞种植组为(495.9±158.9) mm3,P ＜0.05;细胞球种植组荷瘤裸鼠血清PRL[中位数(P25,P75)]为36.08(34.23,41.42) ng/ml,MMQ细胞种植组为21.51 (20.39,22.98) ng/ml,均高于正常对照组的0.26(0.15,1.03) ng/ml,P＜0.05.肿瘤组织HE染色显示,与大鼠垂体腺瘤相似的特征;免疫组化染色显示,PRL和神经突触素(Syn)表达阳性.结论 大鼠垂体催乳素腺瘤MMQ细胞株中存在少量具有肿瘤干细胞样细胞特性的细胞,并能在体外培养成功.
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肿瘤干细胞和上皮-间质转化之间的关系及其在肿瘤侵袭转移中的作用
肿瘤干细胞（ CSCs）是肿瘤中能通过分化成异源的癌细胞系而具有自我更新并保持肿瘤启动能力的细胞。近年来研究表明， CSCs 是肿瘤治疗后复发转移的起源细胞。上皮-间质转化（ EMT）可产生与CSCs分子特征相同的细胞，而且EMT与肿瘤侵袭转移有关，是开启早期肿瘤进入侵袭性恶性表型的关键过程。因此，开发阻止肿瘤细胞发生EMT的治疗策略，将不仅可从源头上消灭肿瘤复发的“种子”，还可抑制早期肿瘤进展为侵袭性表型的过程，从而达到有效防治恶性肿瘤术后复发的目的。
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肝癌Huh7干细胞样细胞的富集培养及鉴定
目的:建立一种体外有效富集、培养和鉴定具有肝癌干细胞特征的细胞亚群的方法.方法:采用成球培养法利用肿瘤干细胞样细胞(cancer stem cell,CSC)分化培养基对肝癌Huh7细胞进行富集培养,获得的干细胞样细胞于体外进一步扩增获得肝癌干细胞球.流式细胞术检测Huh7干细胞样细胞表面肿瘤干细胞标志物EpCAM、CD90和CD133的表达,平板克隆集落形成实验和裸鼠成瘤实验分别检测Huh7细胞和Huh7干细胞样细胞的克隆集落形成能力、体内成瘤能力.结果:Huh7细胞成球培养3～7d后即可形成肝癌干细胞样细胞球,获得的干细胞样细胞具有自我更新和增殖能力,其EpCAM阳性细胞比例较Huh7细胞明显增加[(99.6％±0.31)％vs(0.12％±0.05)％,P＜0.01],但两种细胞CD90[(0.11％±0.06)％vs(0.09％±0.07)％,P＞0.05]和CD133[(0.17％±0.08)％vs(0.15％±0.05)％,P＞0.05]表达差异无统计学意义.Huh7干细胞样细胞克隆集落形成数量明显多于Huh7细胞[(188.67±12.5)vs (79±16.7)个,P＜0.01];当接种量为5 ×104个细胞时,与接种Huh7细胞的对照裸鼠相比,接种Huh7干细胞样细胞的裸鼠成瘤时间更短(11vs 30 d),成瘤率更高(100％vs 16.67％);接种5×105数量级的细胞时,实验组成瘤体积[(171.90±10.94) vs(86.39±11.21)mm3,P＜0.01]和瘤体质量[(2.98 ±0.82)vs(0.32 ±0.17)g,P＜0.01]均明显大于对照组.结论:利用成球培养法能够从Huh7肝癌细胞系中富集培养获得Huh7肝癌干细胞,其具有比Huh7细胞更强的成瘤能力.
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鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的悬浮培养与鉴定
目的 探讨鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的富集与鉴定方法.方法 鼻咽癌细胞株CNE-2Z细胞普通培养至对数生长期,不同密度细胞分别加入无血清培养液中继续培养,制备第9天无血清培养细胞爬片,CD133和CD44克隆抗体免疫组化染色,电镜观察超微结构.结果 无血清悬浮培养至第9天时,以1×l05/ml细胞密度组活细胞比率高;普通培养细胞爬片的CD133和CD44细胞强阳性率分别是2.71%和3.00%,而无血清培养细胞爬片的CD133和CD44强阳性率分别为66.7%和67.00%(P＜0.01),表现正相关(P＜0.01);扫描电镜和透射电镜观察显示,阳性细胞表现特殊的超微结构特点.结论 无血清悬浮培养法可富集鼻咽癌细胞中的肿瘤干细胞样细胞,CD133和CD44可作为其特异性表面标志物.
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人膀胱癌组织中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及PIWIL2表达
目的 从人膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中分离培养肿瘤干细胞样细胞(CSLC),鉴定其生物学特性,并研究PIWIL2在 CSLC中的表达和意义.方法 收集12例不同临床分期BTCC患者组织标本,通过酶消化和原代培养相结合等方法处理,采用无血清悬浮培养法分离培养获得含CSLC的悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;采用半定量逆转录聚合酶链反应检测PIWIL2 mRNA在CSLC中的表达;裸鼠皮下接种CSLC,观察其成瘤能力.结果 成功地从人膀胱癌组织分离培养获得可悬浮生长、稳定传代的CSLC,CSLC高表达CD133和CD44,裸鼠皮下接种1×104、1×105个CSLC均可全部成瘤,PIWIL2 mRNA在CSLC的表达显著高于正常膀胱组织细胞.结论 采用无血清悬浮培养法成功从人膀胱癌组织中分离获得CSLC,具有肿瘤干细胞特性,能高度表达PIWIL2,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供了实验依据.
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K562多药耐药细胞系中肿瘤干细胞样细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究
目的 进一步阐明一些高表达P-糖蛋白(P-gp)的慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼耐药的机制.方法 经过对K562细胞系长期的足叶乙苷(VP16)诱导和克隆筛选,建立一株耐药细胞系K562/VP16;利用干细胞高效能将Hoechst33342荧光染料泵出细胞的特性,采用流式细胞术,从K562/VP16细胞系中分选出一小群细胞,即边缘细胞(SP),称为K562/VP16 SP细胞,并初步探讨其抗伊马替尼的机制.结果 bcr/abl和abl蛋白在K562细胞、K562/VP16 SP细胞及非K562/VP16 SP细胞(non-SP K562/VP16)中的表达水平差异无统计学意义;P-gp在K562细胞中不表达,在K562/VP16 SP及non-SP K562/VP16细胞中均高表达且表达水平一致;与non-SP K562/VP16细胞比较,K562/VP16 SP细胞对伊马替尼的耐药性更强,并且这种抗性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转;另外,体内外实验显示,K562/VP16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562/VP16 SP细胞.结论 bcr/abl基因的扩增、过度表达和多药耐药基因及其蛋白表达产物P-gp的高表达,可能不是白血病细胞产生对伊马替尼临床耐药的重要机制;白血病细胞对伊马替尼具有一定的抗性,可能与数量极少的白血病干细胞有直接的关系.因此,这类数量极少的干细胞样的肿瘤细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞.
关键词： K562多药耐药细胞系 肿瘤干细胞样细胞 伊马替尼 耐药机制
