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THANK重组腺病毒肝癌基因治疗的实验研究
目的在构建THANK腺病毒载体的基础上,在裸鼠体内观察THANK基因转移对SMMC-7721细胞作用.方法用THANK重组腺病毒,感染SMMC-7721细胞,获取高表达THANK基因的7721细胞,将不同7721细胞接种裸鼠,观察THANK基因转移后7721细胞的成瘤性变化,包括肿瘤生长的大小、速率,肿瘤重量、裸鼠生存期变化以及成瘤后肿瘤组织及脾脏的微观结构变化.结果THANK在7721细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的生长,激发机体的抗肿瘤免疫,抑制初次和再次接种的亲代7721细胞的生长,降低了7721细胞的成瘤性.光镜和电镜观察均可发现THANK的转染使得7721细胞的坏死和凋亡比例有所增高,提示THANK在裸鼠体内可能通过某种机制增强了7721细胞的凋亡比例.结论THANK在裸鼠体内可诱发有效的抗肿瘤免疫.
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腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达
目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.
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重组THANK诱导表达和变性、复性及纯化
目的:获得较纯的具有生物学活性的THANK蛋白.方法:THANK基因在大肠杆菌中高效表达,菌体超声破碎后,以洗涤剂反复洗涤包涵体.包涵体经8 mol/L尿素变性溶解后,再用Sephacryl S-200凝胶过滤层析初步纯化,对重组蛋白浓度、氧化还原剂等复性参数进行优化和选择, 将蛋白稀释复性.复性后组分经Q Sapharose Fast Flow离子交换层析再次纯化,后以Sep hadex G-25脱盐.结果:得到了纯度>97%、具有一定生物学活性的THANK蛋白.结论:THANK蛋白变性、复性及纯化方法的建立,为THANK活性蛋白的制备提供了依据.
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人THANK基因的克隆和表达
目的:克隆人THANK基因全长及胞外区片段,将其胞外区在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR技术, 从人白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD18-T载体, 经测序证实,再亚克隆THANK的胞外区片段至pET表达载体,在大肠杆菌中进行表达.结果:RT-PCR扩增出一个858 bp的DNA片段,该片段与公布的人THA NK基因序列一致.诱导后THANK胞外区在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为2.6万的蛋白质 .结论:成功地克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中获得表达,为其功能的研究打下基础.
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重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达
目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.
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人THANK基因转染人肝癌细胞及生物学特性
[目的]将人THANK基因转染入人肝癌细胞SMMU-7721中稳定表达,检测转染后细胞的生物学特性变化.[方法]将由pMD18-T-THANK质粒上获得的THANK全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1中;用脂质体法将pcDNA3-THANK导入人肝癌细胞株SMMU-7721中,G418筛选克隆,再以RT-PCR及Western blot检测THANK的表达,流式细胞仪及细胞毒杀伤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.[结果]THANK在7721细胞中的表达可抑制7721细胞的生长,使肿瘤细胞的生长停滞于S期,且可在体外诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,人外周血单个核细胞(PBMC)对THANK-7721细胞的杀伤活性明显增强.THANK的转染与IFN-γ协同可增强7721细胞的凋亡比例.[结论]THANK基因的转染改变了7721细胞的生物特性,在体外诱导PBMC的CTL反应,有可能用于肝癌的免疫治疗.
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诱导活化的外周血单个核细胞 THANK表达的初步研究
目的分析不同刺激下外周血单个核细胞 (PBMC)中 THANK基因的表达，并克隆全长的人 THANK基因。方法采用将常规方法分离的外周血单个核细胞 (PBMC)培养于含 100ml/L FCS的 RPMI 1640中，并以不同浓度的 LPS、 TNFα、 IL 2、 IFNγ、 PHA及 PMA刺激不同时间。以 RT PCR法，分析 PMBC中 THANK基因的转录表达，并克隆相应的全长人 THANK基因。结果 RT PCR分析表明，当用 IFNγ刺激 PMBC 72h后，可诱导 THANK基因明显表达 ;而 IL 2、 LPS、 TNFα、 PHA和 PMA则不能诱导其表达。采用 PCR产物克隆的方法，克隆了人 THANK基因，并经 DNA序列测定证实。结论克隆得到了人 THANK基因，为进一步研究 THANK的功能打下了基础。
