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THANK重组腺病毒肝癌基因治疗的实验研究
目的在构建THANK腺病毒载体的基础上,在裸鼠体内观察THANK基因转移对SMMC-7721细胞作用.方法用THANK重组腺病毒,感染SMMC-7721细胞,获取高表达THANK基因的7721细胞,将不同7721细胞接种裸鼠,观察THANK基因转移后7721细胞的成瘤性变化,包括肿瘤生长的大小、速率,肿瘤重量、裸鼠生存期变化以及成瘤后肿瘤组织及脾脏的微观结构变化.结果THANK在7721细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的生长,激发机体的抗肿瘤免疫,抑制初次和再次接种的亲代7721细胞的生长,降低了7721细胞的成瘤性.光镜和电镜观察均可发现THANK的转染使得7721细胞的坏死和凋亡比例有所增高,提示THANK在裸鼠体内可能通过某种机制增强了7721细胞的凋亡比例.结论THANK在裸鼠体内可诱发有效的抗肿瘤免疫.
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重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达
目的:克隆人THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性THANK.方法:采用RT-PCR从PMA诱导的 HL60细胞中克隆人THANK全长编码基因,继以PCR扩增出可溶性THANK编码区基因(134～285位氨基酸),PCR产物克隆于pMD-18T,经DNA测序证实后亚克隆到pET-11a中.重组质粒转化B L21,以1 mmol/L IPTG进行诱导表达产物,SDS-PAGE分析表达产物,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性.结果:RT-PCR扩增出编码人THANK全长编码基因及P CR扩增出THANK134-285基因的cDNA,经序列分析证实与文献报道完全一致.含有THA NK134-285编码基因的表达载体,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约18 000的重组蛋白.该重组蛋白经纯化后能够诱导U937细胞凋亡.结论:成功克隆了人THANK基因,并在大肠杆菌中表达重组可溶性THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导U937细胞凋亡的作用.
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外周血单核细胞LIGHT的诱导表达及基因克隆
目的:分析细胞因子对外周血单核细胞LIGHT基因的诱导表达,并克隆人LIGHT基因.方法:采用新鲜健康人外周血单核细胞(PM BC),分别以LPS、TNFα、IL-2、IFN-γ及PMA刺激以诱导LIGHT基因表达,RT-PCR分析P MBC内LIGHT基因转录表达.采用PCR产物直接克隆法克隆人全长LIGHT基因及其胞外区编码基因,并对胞外区编码基因进行大肠杆菌表达.结果:当用IFN-γ和PM A刺激PMBC后48 h,可诱导LIGHT基因的明显表达,而LPS、IL-2和TNFα则不能诱导.克隆的人LIGHT全长基因及LIGHT胞外区编码基因,经过DNA序列测定证实基因序列与文献报道一致.LIGHT基因胞外区在大肠杆菌获得一定程度的表达.结论:本研究对人LIGHT基因及其胞外区编码基因进行了克隆和表达,为进一步研究其功能打下基础.
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大鼠4-1BBLcDNA的克隆、分析及染色体定位
目的克隆、分析并染色体定位肿瘤坏死因子配体超家族(Tumor Necrosis Factor Superfamily,TNFSF)成员4-1BBL分子.方法在对小鼠、人4-1BBL mRNA进行生物信息学分析的基础上,采用PCR扩增、T载体克隆测序等实验技术,并用软件对基因进行了拼接、序列分析及同源性比较,同时通过荧光原位杂交(FISH)技术对该基因进行了染色体定位.结果首次获得了具有完整开放阅读框的大鼠cDNA,GenBank 登录号为 No. AY259541,通过同源性比较分析,证明该基因与小鼠高度同源,编码区的核苷酸序列与小鼠、人的同源性分别为 88%、37%.推导出的大鼠4-1BBL蛋白质由308个氨基酸分子组成,分子量为33469d,胞外区有三个潜在的N糖基化位点:AA138,AA160和AA292,是典型的Ⅱ型糖蛋白,与小鼠、人在氨基酸水平的同源性分别为83%、31%,其中胞质区为76%、32%,跨膜区为45%、40%,胞外区为87%、28%.该基因定位于大鼠染色体9q1(GenBank UniGene 登录号为No.Rn.46783).结论大鼠4-1BBL胞内区的"SDAA"可能发挥着TNF家族中具有逆信号的其他成员的胞内区酪氨酸激酶Ⅰ磷酸化位点"SXXS"的作用.大鼠4-1BBLcDNA的成功克隆与定位为探讨4-1BBL在免疫共刺激中的作用机制以及TNF分子的进化研究打下了基础.
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诱导活化的外周血单个核细胞中LIGHT基因的表达分析及其克隆
目的分析不同刺激下外周血单个核细胞(PBMC)中LIGHT基因的表达,并克隆全长的人LIGHT基因.方法按常规方法分离正常人的外周血单个核细胞后,培养于含10%FCS的RPMI1640中,并以不同浓度的LPS、TNFα、IL-2、IFN-γ、PHA及PMA刺激不同的时间,再以RT-PCR法分析PMBC内LIGHT基因转录表达,并克隆相应的全长人LIGHT基因.结果 RT-PCR分析表明:当用LPS和IFN-γ刺激PMBC 24h后,可诱导LIGHT基因的明显表达,而单独应用IL-2、TNFα、PHA和PMA则不能诱导其表达.采用PCR产物克隆方法,克隆了人LIGHT基因,并经DNA序列测定证实.结论本实验克隆得到了人LIGHT基因,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.
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诱导活化的外周血单个核细胞 THANK表达的初步研究
目的分析不同刺激下外周血单个核细胞 (PBMC)中 THANK基因的表达，并克隆全长的人 THANK基因。方法采用将常规方法分离的外周血单个核细胞 (PBMC)培养于含 100ml/L FCS的 RPMI 1640中，并以不同浓度的 LPS、 TNFα、 IL 2、 IFNγ、 PHA及 PMA刺激不同时间。以 RT PCR法，分析 PMBC中 THANK基因的转录表达，并克隆相应的全长人 THANK基因。结果 RT PCR分析表明，当用 IFNγ刺激 PMBC 72h后，可诱导 THANK基因明显表达 ;而 IL 2、 LPS、 TNFα、 PHA和 PMA则不能诱导其表达。采用 PCR产物克隆的方法，克隆了人 THANK基因，并经 DNA序列测定证实。结论克隆得到了人 THANK基因，为进一步研究 THANK的功能打下了基础。
