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Fsp27基因抑制原代肝星状细胞活化与活性的实验研究
目的 探讨脂肪特异性蛋白27(fat-specific protein 27,Fsp27)基因对原代肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖活化的影响和对纤维化相关基因的调节作用.方法 实时定量PCR检测原代与活化HSCs中Fsp27基因表达.构建携带Fsp27的慢病毒并转染原代HSCs.CCK-8比色法检测Fsp27基因对HSCs增殖的影响.Western blotting检测HSCs α肌动蛋白(α-SMA)的表达,实时定量PCR检测Fsp27基因对HSCs纤维化相关基因表达的影响.结果 原代与活化HSCs的Fsp27表达差异有统计学意义(Fsp27 mRNA:2 700 ±500,5±2,t=124.27,P＜0.0S).带Fsp27目的基因的慢病毒转染原代HSCs 72 h后可明显抑制HSCs的活化(66.2±3.8,37.5±4.3,21.7±1.4,F=43.27,P＜0.05)与增殖(48 h:31.5±1.3,6.1±0.1,t=17.35,P＜0.05;72 h:36.2±2.2,6.2±0.1,t=21.94,P＜0.05);Fsp27基因促进基质金属蛋白酶2表达(0.48 ±0.02,0.85±0.14,1.63±0.21,F=41.56,P＜0.05),降低转化生长因子β1表达(3.2±0.17,2.0±0.3,1.7±0.2,F=21.52,P ＜0.05).结论 Fsp27基因抑制原代HSCs活化增殖,调节纤维化相关基因的表达,可能与维持HSCs静息状态细胞表型有关.
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新型荧光探针mMaple3与mEos3.2应用于Fsp27介导脂滴融合的功能研究
目的:Fsp27已经被证明定位在脂滴上并且介导脂滴融合与增大.为研究Fsp27介导脂滴融合的动态分子机制,我们构建了Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型荧光探针的融合蛋白并研究其对脂滴融合的功能影响,进而为研发Fsp27相关生理功能的光学显像技术奠定基础.方法:对照传统绿色荧光的融合蛋白Fsp27-EGFP,在共聚焦显微镜下观察Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型融合蛋白的亚细胞定位和介导脂滴融合的功能,并利用荧光漂白恢复术(fluorescence recovery afterphoto-bleaching,FRAP)以判断脂滴与脂滴之间是否存在脂的交换.结果:表达Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2两种新型融合蛋白的细胞中脂滴显著增大;同时,融合蛋白皆集中在脂滴与脂滴的接触位点上,且中性脂的交换实验显示脂滴与脂滴之间可以相互连通.结论:我们建构的两种新型荧光探针融合蛋白Fsp27-mMaple3和Fsp27-mEos3.2保持了Fsp27介导脂滴融合的功能,并为我们进一步研发新型的超分辨光学显像技术提供功能基础.
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Fsp27与肝纤维化病理、肝纤维化指标的相关性
目的:探讨Fsp27在慢性肝纤维化患者肝组织中的表达及其与病理、肝纤维化指标之间的相关性.方法:选取2015年7月至2017年7月温州医科大学附属第一医院45例因肝脏肿瘤而行肝部分切除术切除的肝脏标本.对肝组织进行HE染色、Masson染色、Fsp27蛋白染色,并进行病理纤维化分析,分别通过免疫组织化学染色、Real-time PCR及Western blot检测肝组织中Fsp27表达情况,同时测定患者术前血清肝纤维化指标(血清肝羟脯氨酸、血清III型胶原和透明质酸).结果:Fsp27在肝组织中阳性表达主要位于原代肝星状细胞;随着肝纤维化程度的加重,肝脏组织中Fsp27 mRNA及蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05);Fsp27蛋白染色评分与血清III型胶原、血清透明质酸、肝脏羟脯氨酸呈负相关(r=-0.521、-0.834、-0.667,P<0.05).结论:肝组织Fsp27表达与肝纤维化程度、肝纤维化指标呈显著负相关.
