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VLA-4单克隆抗体那他珠单抗(Natalizumab)动员人CD34+造血干细胞的临床研究
VLA-4是表达于造血细胞表面的β-1整合素家族的α-4亚单位,是与CD34+细胞动员和迁移有关的黏附分子.骨髓来源的CD34+细胞VLA-4表达量显著高于外周血CD34+细胞,提示VLA-4的表达与造血干细胞动员到外周血有密切的关系.VLA-4单克隆抗体那他珠单抗(Natalizumab)被用于治疗自身免疫性疾病,如多发性硬化、Crohn病等,本研究旨在探讨Natalizumab在动员CD34+造血干细胞中的作用.
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PTICE治疗TNBS诱发的小鼠结肠炎机制研究
目的 研究河鲀I型胶原蛋白(PTICE)治疗2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱发的小鼠结肠炎的作用机制.方法 用75 mg/kg TNBS的40%乙醇溶液灌肠诱发小鼠结肠炎;以柳氮磺吡啶为阳性对照,分别以0.3、0.6或1.2 g/(kg.d) PTICE灌胃给药,治疗5 d;TBA法测定丙二醛(MDA)含量;化学发光法测定Caspase-3活性;放免分析法(RIA)测定血管活性肠肽(VIP)含量;流式细胞术测定外周血CD34+造血干细胞水平.结果 病理模型组结肠重/cm、结肠MDA含量和Caspase-3活性较正常对照组均极显著升高(P<0.01),结肠VIP含量极显著降低(P<0.01),CD34+造血干细胞水平有所降低;经PTICE各剂量治疗后,小鼠结肠重/cm、结肠MDA含量和Caspase-3活性较病理模型组均显著降低(P<0.05或0.01),且PTICE各剂量治疗组结肠Caspase-3活性以及1.2 g/kg PTICE治疗组结肠重/cm和结肠MDA含量均恢复至正常水平(P>0.05);PTICE高或中剂量治疗组结肠VIP含量和外周血CD34+造血干细胞水平较病理模型组极显著升高(P<0.01).结论 PTICE通过升高结肠组织VIP含量和动员CD34+造血干细胞的双重作用,抑制结肠细胞凋亡和过氧化损伤,有效抑制IBD炎症症状,治疗IBD.
关键词： PTICE 结肠炎 Caspase-3 CD34+造血干细胞 血管活性肠肽 -
肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的影响
背景:造血干细胞是构筑免疫系统的早的细胞,能分化为多种细胞,其中具有包括免疫应答调控树突状细胞.树突状细胞的诱导培养因前体细胞来源不同,所采用的细胞因子,及佳的细胞因子配伍、应用顺序、实验室培养条件亦不相同,树突状细胞的发育、各种表犁的表达及成熟度也不尽相同.目的:观察肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导培养体系的影响,探寻该培养体系优化方法.设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03/11在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成.材料:健康新生儿脐血为南京市八一医院产妇同意捐赠.CD34单克隆抗体一磁珠分离系统为德国Miltenyi Biotec公司产品:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素4和重组人肿瘤坏死因子α为美国PeproTech公司产品.方法:淋巴细胞分离液分离获得脐血单个核细胞,免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞,并用流式细胞术鉴定CD34+造血干细胞纯度:比较GT(GM-CSF+肿瘤坏死因子α)方案和GTI(GM-CSF+肿瘤坏死因子α+自细胞介素4)方案及GTI方案中肿瘤坏死因子α和白细胞介素4不同时段加入对诱导培养产生的树突状细胞成熟的影响;通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型及3H-TdR检测树突状细胞激发异体T细胞增殖能力.结果:免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞纯度町达90%以上.将CD34+造血干细胞按GT方案和GTI方案进行培养.均可诱导产生树突状细胞,CD34的阳性表达率逐渐下降,HLA-DR的表达下降(P＜0.05),树突状细胞的相关分化抗原CD80,CD86,CD83和CDla的表达均相应增加,培养13～15 d的细胞各表型表达较7～9 d,10～12 d充分.但经GT方案诱导的树突状细胞CD14表达较高,cD80,CDB6,CD83,CD1a表达不如经GTI方案诱导的高;而GTI方案中,以肿瘤坏死因子aoh、白细胞介素448 h加入诱导培养的树突状细胞各表型表达相对较佳,其细胞表达CD80,CD86均较其他组高,尤以CD86表达为著,并具有激发异体T细胞增殖能力.结论:CD34+造血干细胞经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性树突状细胞,以GM-CSF与肿瘤坏死因子α O h加入、白细胞介素4 48 h加入的GM-CSF+肿瘤坏死因子α+白细胞介素4方案更为可取.
关键词： 脐血 CD34+造血干细胞 树突状细胞 体外培养 -
巨噬细胞分化的研究现状
巨噬细胞是机体的重要免疫细胞之一,在特异性免疫反应的诱发和免疫调节中起关键作用.巨噬细胞是一种多分化来源的细胞,单核细胞、CD34+造血干细胞及早期T淋巴细胞等在适当的因素作用下可分化成巨噬细胞,不同细胞来源的与不同因素诱导分化的巨噬细胞在功能与生物学特性方面有很大差异.
关键词： 巨噬细胞 分化 单核细胞 CD34+造血干细胞 早期T淋巴细胞 -
地中海贫血患儿群体反应性抗体对脐血CD34+细胞集落形成的影响
目的 探讨特异性群体反应性抗体(Panel Reactive Antibody,PRA)对脐血CD34+细胞集落形成的影响.方法 取含PRA的β地贫患儿血清,与脐血CD34+细胞、补体联合孵育,行半固体集落培养,观察其对CD34+细胞集落形成影响.结果 经PRA阳性血清孵育的脐血CD34+细胞经半固体集落培养所形成的集落数下降.结论 地中海贫血血清PRA对脐血CD34+细胞的集落形成能力有抑制作用,补体可增强上述作用.
关键词： 脐血 CD34+造血干细胞 地中海贫血 群体反应性抗体 -
人PBMC和脐血CD34+细胞诱导DC2的实验方法研究
目的:探讨从人外周血单个核细胞(PBMC)和脐血CD34+造血干细胞(HSC)诱导DC2方法.方法:分别用rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)和rhFlt-3L(100ng/ml)+rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)诱导人PBMC和脐血CD34+HSC向DC2分化,并采用流式细胞仪分析细胞的表型,同时观察rhTNF-α和人CD40单抗诱导DC2分化成熟的作用.结果:rhG-CSFh+rhIL-3未能较好地从PBMC中诱导出DC2,但是从富集的脐血CD34+HSC用rhFlt-3L+rhIL-3+rhG-CSF诱导,可以获得相对较多的DC2,并有较高的扩增效率,但离临床研究和应用还有一定距离,因此DC2的诱导方法仍需进一步优化.人CD40单抗和rhTNF-α一样,能有效地诱导DC2分化成熟.结论:体外联合多种细胞因子从CD34+HSC成功地诱导出DC2,抗人CD40单抗有利于DC2的活化成熟.
关键词： CD34+造血干细胞 rhFlt-3L rhIL-3 rhG-CSF DC2 -
不同标记法及去红细胞法对检测微量脐血CD34+造血干细胞含量的影响
目的采用ISHAGE(international society of hematotherapy and graft engineering)法和常用的CD34+造血干细胞流式检测方法对同一脐血样品进行比较实验,确定更适用于微量脐血CD34+造血干细胞含量检测的方法.方法分别采用ISHAGE造血干细胞计数协会推荐方法、低渗NH4Cl去红细胞CD45/CD34双色标记法(NH4Cl双标法)、Optilyse C溶血剂去红细胞CD34单色标记法(Optilyse C单标法)、低渗NH4Cl去红细胞CD34单色标记法(NH4Cl单标法)、羟乙基淀粉沉淀去红细胞CD45/CD34双色标记法(HES双标法)检测脐血造血干细胞含量,并比较不同方法测得数据的差异.结果 8份脐血标本用ISHAGE方法测得CD34+造血干细胞含量的中位数为0.278%,NH4Cl双标法测得结果为0.297%,与ISHAGE方法相比差异无显著性.用HES双标、Optilyse C单标法和NH4Cl单标法测得的结果分别为5.715%,0.391%和0.741%,与ISHAGE方法相比差异有显著性.结论 ISHAGE方法是一种公认的准确性高,重复性好的检测造血干细胞方法.Optilyse C单标法、NH4Cl单标法和HES双标法测定结果比实际值偏高.
关键词： 脐血 CD34+造血干细胞 流式细胞仪 -
CD34+脐血造血干细胞的体外培养及其生物学特性研究
目的:建立稳定的CD34+脐血造血干细胞(CD34+UHSC)的体外分离、培养扩增体系,并研究其生物学特性.方法:密度梯度离心及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+UHSC,加入细胞因子SCF、IL-3和IL-6进行体外培养扩增,观察细胞形态及其生长特性.应用流式细胞仪测定细胞周期及其CD34分子的表达,研究其增殖、生长和分化特性.以RT-PCR法检测干细胞高表达基因ABCG2的转录表达.结果:在体外培养条件下,CD34+UHSC悬浮生长,约1周后易形成克隆球,增殖旺盛,呈现指数生长期;细胞增殖周期随体外培养时间延长而逐渐趋缓;CD34+UHSC表面标志亦随体外培养时间延长而表达下降,同时ABCG2基因的表达亦逐步下调. 结论:体外获得纯化的 CD34+UHSC,生长稳定、增殖能力强,但随体外培养时间的延长,CD34+分子标志逐步丢失,提示在增殖旺盛的指数生长期7～21 d内适用于各项相关实验研究.
关键词： 脐血 CD34+造血干细胞 体外培养 流式细胞术 -
C57BL/6j小鼠骨髓CD34+造血干细胞来源的iDC的体外培养与鉴定
目的:探讨以恰当的体外定向诱导和培养小鼠骨髓CD34+造血干细胞以获得足够数量的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)的方法.方法:采用自健康C57BL/6j小鼠骨髓中分离CD34+造血干细胞,进而于含rmGM-CSF和rmIL-4的RPMI-1640完全培养液中定向诱导和扩增,收集悬浮生长细胞后,予以流式细胞学检测其CD80、CD86和CD11c等表面分子的表达,扫描电镜观察悬浮细胞的形态.结果:去除红细胞的骨髓细胞培养4 h后,10%左右细胞贴壁生长.加rmGM-CSF和rmIL-4培养,逐渐呈集落样悬浮生长,有树枝状突起.第6天时,细胞集落呈密集的葡萄串状,细胞体积增大,毛刺状或根须状突起更明显.流式细胞学显示:体外培养第7天的iDC的表面分子CD11c的表达率为75%～81%[(78.4±8.36)%],表面分子CD80的表达率为32%～51%[(38.26±8.77)%],而表面分子CD86的表达率为18%～53%[(27.5±8.30)%].扫描电镜见细胞有典型的树枝状突起.结论:联合使用rmGM-CSF和rmIL-4定向诱导培养骨髓CD34+造血干细胞,可大量扩增出iDC.
关键词： 小鼠 CD34+造血干细胞 未成熟树突状细胞 -
慢病毒转染脐血CD34+造血干细胞方法的优化
目的 探讨慢病毒载体系统转染人脐血CD34+造血干细胞优化的转染方法.方法 采用第二代、第三代慢病毒载体系统,通过改变病毒浓度、感染体积、感染复数(MOI)值、感染方式、感染时间和感染后培养基等各方面条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pTRIPdU3-RNAiTALh-EF1a-GFP转染CD34+干细胞,于37℃、5％ CO2的孵箱中培养14 d后,在光学显微镜下进行集落计数和分类,并与未转染的CD34+干细胞进行比较,从而筛选出优化的转染方法.结果 三质粒系统的第二代慢病毒载体转染率高于四质粒系统的第三代慢病毒载体.优化的转染条件为:新鲜分选的CD34+细胞于当日(0 d),在含病毒滴度107TU、Polybrene 2 μg/mL的optiMEM培养液中,细胞和病毒混合液于平底12孔板孔中,200×g离心1h,离心后继续共培养8h,再换新的病毒液200×g离心1h,共培养8h.按照含细胞因子的液体培养基:半固体培养基=1∶1的比例配置转染后培养基,继续培养,可以获得较高感染率.感染病毒后的CD34+干细胞培养14 d后,与未感染的CD34+细胞相似,可以形成各类血细胞集落.结论 优化的慢病毒转染方法可以有效感染CD34+造血干细胞,而不影响干细胞的分化功能.
关键词： 慢病毒载体 CD34+造血干细胞 基因转染 -
CD34+造血干细胞诱导T细胞免疫耐受
目的观察CD34+造血干细胞诱导针对供者特异性T细胞免疫耐受作用.方法从健康异基因造血干细胞移植供者采集外周血单个核细胞,用联结抗CD34+单抗磁珠纯化CD34+细胞.从健康供者分离反应淋巴细胞(RLs),1×106RLS分别与(0、0.25、0.5、1)×106CD34+细胞混合培养.刺激细胞来自于CD34+细胞同一供者或第三者.混合淋巴细胞反应(3H-TdR掺入法)检测T细胞增殖活性.结果T细胞增殖实验显示:CD34+细胞:RLs比例为0.5或更高混合培养的淋巴细胞,对来自于CD34+细胞供者的刺激细胞激活作用明显抑制,而对于来自第三者的刺激细胞的激活作用无明显抑制.结论CD34+造血干细胞具有诱导针对供者特异性T细胞免疫耐受的作用.
关键词： CD34+造血干细胞 诱导 免疫耐受
