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卵巢上皮性肿瘤组织中Bub1蛋白的表达及其意义
基因组的不稳定性和异倍体细胞的存在是肿瘤细胞的遗传学特征之一,而纺锤体的失控是其重要原因之一.纺锤体检查点,又称有丝分裂检查点,是细胞在长期的进化过程中产生的监控纺锤体形态、染色体着丝点与微管联接及其产生的张力、染色体排列、确保姐妹染色单体精确分离的质控机制[1-2].Bub1作为纺锤体检测点蛋白,可能通过染色体不稳定性和非整倍体传代促进肿瘤发生.对于卵巢癌患者,微管稳定剂紫杉醇类药物现已广泛应用于临床,但耐药现象仍频繁出现,相关研究指出,紫杉醇类药物的敏感性必须依赖于功能完整的纺锤体检查点[3-4].纺锤体检查点与肿瘤耐药机制研究是目前国际肿瘤研究的热点之一,国内相关研究尚处于起步阶段,仅限于乳腺癌、结直肠癌和胃癌方面.本研究旨在探讨不同卵巢组织中Bub1蛋白的表达水平,以进一步了解纺锤体检查点的作用机制,为卵巢癌化疗耐药机制及其分子逆转研究奠定相关基础.
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纺锤体检查点生物学特性与肿瘤
纺锤体检查点是在细胞有丝分裂期保证染色体正确分离的重要监控机制,维持着基因组稳定性.纺锤体检查点的分子调控机制已逐步明确,许多肿瘤细胞存在纺锤体检查点功能缺陷,纺锤体检查点表达量的失调、基因单核苷酸多态性及启动子甲基化等可能与其功能异常有关.抗肿瘤药物通过影响纺锤体检查点的表达而启动杀伤肿瘤效应.深入了解肿瘤纺锤体检查点调控机制,有助于发现新的杀灭肿瘤细胞的靶向化疗药物.
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纺锤体检查点蛋白Cenp-E过低表达与肝癌细胞染色体异常的关系
目的:探讨纺锤体检查点蛋白E(Cenp-E)基因在肝癌细胞中的定位和作用,为进一步阐明肝癌细胞染色体数目异常的机理奠定基础.方法:利用FQ-PCR检测Cenp-E基因在用Nocodazole(诺考达唑)同时处理HepG-2细胞和LO2细胞中mRNA的表达水平.用间接免疫荧光技术观察Cenp-E蛋白在用Nocodazole(诺考达唑)同时处理HepG-2细胞和LO2细胞中的定位及表达.在LO2细胞中用RNAi技术干扰Cenp-E基因后,用FQ-PCR检测Cenp-E基因在干扰前后mRNA表达水平.并利用间接免疫荧光进一步评价干扰后的细胞功能情况.结果:Nocodazole处理前Cenp-E基因和蛋白在LO2和HepG-2细胞中表达无显著差异,处理后Cenp -E基因和蛋白在两种细胞表达都增高,但LO2细胞上调水平大于HepG-2细胞,差异具有统计学意义.间接免疫荧光结果显示Cenp-E蛋白主要定位细胞核内,并且在出现异常分裂的细胞核内Cenp-E蛋白的表达明显低于正常分裂的细胞核.在干扰Cenp-E后,间接免疫荧光显示干扰后的LO2细胞中出现核异常比例明显高于正常细胞.结论:Cenp-E过低表达可能是肝癌细胞染色体数目异常重要原因之一.
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BubR1基因表达对肝癌细胞对紫杉醇的敏感性的影响
目的：探讨BubR1基因在紫杉醇治疗肿瘤中的作用。方法：构建针对BUBR1基因的特异性短发夹RNA载体，导入人肝癌细胞株HepG-2，转染48 h后，运用实时荧光定量PCR、Western 印迹法评价RNA干扰效果；BubR1表达下调的肝癌细胞及对照组细胞用不同浓度(1、3、10、30、100、300、1000和3000 nmol/L)的紫杉醇处理，MTT法检测细胞增殖情况。结果：shRNA-BubR1可有效抑制BubR1的mRNA、蛋白水平以及内源性表达。 MTT结果显示，BubR1表达下调的细胞在不同浓度紫杉醇作用下的增殖抑制率与对照组相比明显增加(P<0.05)，并呈现剂量依赖性。结论：下调BubR1的表达能增强肝癌细胞对紫杉醇的敏感性。
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纺锤体检查点蛋白Cenp-E在肝癌组织的表达及临床意义
目的 观察纺锤体检查点蛋白(Cenp-E)在肝癌组织和人类正常肝组织表达水平的差异,以探讨Cenp-E蛋白在肝癌细胞中的表达及临床意义. 方法 用荧光定量PCR和Western blot分别检测Cenp-E基因和蛋白在肝癌组织和正常肝组织的表达水平. 结果 正常肝组织中Cenp-E基因mRNA水平(0.023 78±0.009 73)明显高于肝癌组织(0.014 58±0.008 73);Cenp-E蛋白表达量在正常肝组织中(0.656±0.012)明显高于在肝癌组织中的表达(0.301±0.009),且二者有显著性差异. 结论 Cenp-E低表达在肝癌的发生过程中起重要作用.
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纺锤体检查点蛋白BubR1在肝癌组织和肝癌细胞株HepG2中的表达
目的 观察纺锤体检查点蛋白BubR1在人类肝癌组织、正常肝组织以及肝癌细胞系(HepG2)、正常肝细胞系(LO2)有丝分裂期表达水平的差异,以探讨BubR1蛋白在肝癌发生中的作用.方法 用荧光定量PCR和Western blot检测BubR1基因在肝癌组织、正常肝组织,以及在2种细胞中用Nocodazole处理前后的mRNA和蛋白的表达水平.结果 BubR1基因在正常组织中的表达高于肝癌组织,在Nocodazole处理前2种细胞中表达无显著差异,在处理后2种细胞中表达均增高,但在LO2细胞中上调水平大于HepG2细胞.结论 BubR1基因低表达可能在肝癌的发生过程中起重要作用.
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CENP-E蛋白动力结构域对细胞周期及染色体分离的影响
目的:克隆含CENP-E蛋白动力结构域的真核表达载体,并观察其对染色体分离的影响.方法:采用RT-PCR、分子克隆技术获得含CENP-E动力结构域的真核表达载体pEG-FP-CENPE1(1～336位氨基酸),pEGFP-CENPET1(包括1～336和2078～2492位氨基酸),通过流式细胞术、染色体核型分析观察CENP-E蛋白动力结构域对染色体分离的影响.结果:成功构建出pEGFP-CENPE1,pEGFP-CENPET1融合质粒并在HEK293细胞中正确表达;流式细胞术和染色体核型分析结果表明:转染含CENP-E蛋白动力结构域的载体的细胞在用破坏纺锤体微管药物处理后不能保持于细胞分裂中期,细胞提前进入分裂后期;非整倍体细胞数目增多.结论:过度表达含CENP-E动力结构域不能使受诺考达唑处理的细胞保持于分裂中期,染色体分离出现错误,非整倍体数目细胞增多.
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纺锤体检查点功能复合物基因MAD1L1遗传变异与潮汕地区女性乳腺癌易感性研究
目的:研究纺锤体检查点功能复合物基因MAD1L1基因变异与潮汕地区女性乳腺癌易感性的关系.方法:采用病例-对照研究,收集2015年12月-2017年12月在汕头大学医学院附属肿瘤医院住院的乳腺癌新发病例191例及同期社区健康对照225例,采用TaqMan荧光双标记探针法对MAD1L1基因位点rs1801368进行基因分型.同时收集其人口学特征、女性生理生育相关信息、生活方式、既往病史及乳腺癌患者临床病理指标.结果:MAD1L1 rs1801368位点基因型CC、CT、TT的频率分布在病例组中分别为20.63％、42.86％、36.51％,在对照组中分别为30.14％、41.15％、28.71％,两组中分布的差异无统计学意义(P＞0.05).多因素分析表明,调整了年龄、初潮年龄、绝经状态等混杂因素后,相较于野生型纯合子CC,突变型纯合子TT增加乳腺癌患病风险(OR=3.399,95％CI:1.288～8.973,P=0.013).结论:MAD1L1基因位点rs1801368多态性与潮汕地区女性乳腺癌易感性可能相关,携带TT基因型的较携带CC或CT基因型的女性患乳腺癌的风险高.
