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MYCN基因表达抑制促TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究
目的 神经母细胞瘤(NB)为小儿常见恶性肿瘤.MYCN基因高扩增NB细胞对TRAIL诱导凋亡多有抵抗.我们以MYCN基因高扩增NB细胞株为研究对象,抑制其MYCN基因的表达,探讨其对TRAIL诱导凋亡有无增强作用.方法 构建MYCN siRNA,转染NB细胞株SK-N-BE(2),抑制MYCN基因表达后,Western-blot法检测SK-N-BE(2)细胞Bcl-2、Bcl-xL、Bid、DR4、DR5表达的变化,ELISA法检测细胞凋亡.结果 转染MYCN siRNA的SK-N-BE(2)细胞中MY-CN基因表达显著降低(P＜0.05).MYCN基因表达抑制后,sK-N-BE(2)细胞DR5、Bid表达增高(P＜0.05),Bcl-2、Bcl-xL表达降低(P＜0.05),DR4表达无变化(P＞0.05),TRAIL诱导细胞凋亡显著增强(P＜0.05).结论 MYCN基因表达抑制后,可调控Bcl家族中相关蛋白、DR5的表达,促进TRAIL诱导NB细胞凋亡.
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儿童神经母细胞瘤染色体分析
目的总结55例神经母细胞瘤（NB）患儿的染色体结果，分析与临床特点及近期治疗效果的关系，提高对伴有染色体异常NB的认识。方法回顾性分析55例NB患儿的临床资料，包括分期分组、肿瘤标记物、染色体结果、治疗方案及近期预后情况。结果55例NB患儿中有4例存在17q获得（7％），1例患儿同时存在17q获得及1 p缺失（2％），余50例（91％）患儿染色体检查均正常。伴有染色体异常的5例患儿肿瘤标记物在病初均有不同程度的增高，而且血神经元特异性烯醇化酶（NSE）高于染色体正常组；5例染色体异常患儿均为Ⅳ期、高危组，均伴有MYCN基因获得，其中1例在治疗过程中失访，余4例中有2例肿瘤进展，1例死亡，1例经化疗联合手术切除及自体造血干细胞移植，门诊随访33个月疾病稳定。结论结果提示染色体1 p缺失和17q获得可能是NB的预后不良因素，染色体异常在NB的诊断及预后评估中具有一定临床指导意义。但本研究中的异常染色体检出率偏低，考虑与常规检测的误差有关，方法学有待进一步改进。
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中高危儿童神经母细胞瘤治疗过程中发生进展的预测及监测指标
目的 本研究旨在探讨神经母细胞瘤(NB)相关临床及分子生物学特征对中高危NB患儿治疗过程中发生肿瘤进展的预测价值;并分析NB相关肿瘤标记物的监测作用.方法 回顾性分析2015年1月-2017年1月就诊于首都医科大学附属北京儿童医院并住院进行治疗的原发病灶位于腹部的中高危NB患儿临床资料.根据治疗过程中是否发生病情进展分为进展组与未进展组,分析NB相关指标在两组患儿间的差异,并通过Logistic回归分析变量与肿瘤进展的关系,寻找预测肿瘤进展的佳因素.结果 MYCN基因扩增(P=0.001)及首诊时发生骨髓转移(P=0.01)与治疗过程中发生肿瘤进展明显相关,是独立预测因素;此外,当发生肿瘤进展时,经过治疗后已趋于正常的肿瘤标记物水平又会出现急剧上升(P =0.001).结论 MYCN基因扩增与首诊时发生骨髓转移是中高危NB患儿在治疗过程中发生肿瘤进展的独立预测因素;并且,肿瘤标记物水平变化可提示病情进展,因此在NB诊疗过程中监测肿瘤标志物具有重要意义.
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以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA体外抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖
目的 以氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA,研究其体外对神经母细胞瘤LA-N-5细胞MYCN基因表达的抑制及细胞增殖的影响.方法 制备氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹CY3标记的MYCNsiRNA转染LA-N-5细胞,以每微克蛋白中荧光强度半定量siRNA的转染效果;用定量RT-PCR检测转染前后MYCN基因mRNA变化;MTT法检测细胞增殖受抑情况.结果 以100nmol/L终浓度转染LA-N-5细胞后每微克蛋白含siRNA(1808.5±140.2)pg,作用72h MYCN基因mRNA表达显著下降,抑制率79.2%,瘤细胞增殖受抑达66.2%.结论 叶酸受体为靶向脂质体介导MYCNsiRNA在体外对LA-N-5细胞MYCNmRNA表达有显著抑制作用,明显抑制LA-N-5细胞增殖,为神经母细胞瘤靶向治疗、基因治疗开辟了新的思路.
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MYCN基因监测在儿童恶性实体瘤中的临床研究进展
恶性实体瘤在儿童中发病率不高,却是儿童主要死亡原因.MYCN基因扩增是神经母细胞瘤的独立的不良预后因素,参与神经母细胞瘤肿瘤形成,是分层治疗的重要依据.同时MYCN基因扩增在其他儿童恶性实体瘤中亦可检测到,并与髓母细胞瘤的不良病理表现、肾母细胞瘤和肺泡型横纹肌肉瘤的不良预后有关.该文比较MYCN基因的各种检测方法,总结其与儿童实体瘤的临床关系,探讨分子特异性治疗提高儿科实体瘤治愈率的可能.
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MYCN转基因斑马鱼对造血调控因子的影响
目的:通过热激活启动子条件性过表达鼠源性MYCN基因,建立生殖系稳定转染的斑马鱼系.以研究MYCN基因对造血调控因子转录的影响.方法:构建携绿色荧光蛋白"报告基因"的MYCN质粒.显微注射到斑马鱼胚胎单细胞期,通过荧光筛选出FO代,继而建立生殖系稳定转染的转基因鱼系.通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)血涂片论证MYCN基因的过表达及其对造血调控因子的影响.结果:在256条嵌合表达的性成熟阳代斑马鱼中,鉴定发现有18条(7.0%)1显示转基因阳性,其中雄鱼8条,雌鱼10条.同时,RFQ-PCR及外周血涂片均显示,转基因斑马鱼F1和F2代均发生明显的造血分化障碍,造血关键调控因子scl、mpo、gatal基因表达量明显下降.结论:斑马鱼在基因研究中具有直观及规模化优势.特别适用于单一基因的研究,MYCN基因产物可显著抑制红系生成和造血分化.
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RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究
目的对RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞(LAN-5) MYCN基因表达进行初步研究.方法体外化学合成针对MYCN基因的小干扰RNA(siRNA),经脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染神经母细胞瘤细胞,以无关 siRNA和未转染的细胞为对照,采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量 RT-PCR检测siRNA的抑制效果.结果脂质体转染 siRNA效率可达84.83%,化学合成的siRNA可抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA表达,转染72 h后抑制率达58.3%.结论化学合成的siRNA可以有效抑制神经母细胞瘤MYCN基因的表达,为神经母细胞瘤基因治疗开辟了新的途径.
关键词： 神经母细胞瘤 MYCN基因 小干扰RNA 荧光定量RT-PCR -
13-顺式维甲酸体外诱导3种神经母细胞瘤细胞株分化研究
目的 探讨13-顺式维甲酸(13-cis RA)体外对3种人神经母细胞瘤(NB)细胞株生长的影响及其作用机制.方法 常规培养SH-SY5Y、SK-N-SH和SK-N-BE2细胞株,荧光原位杂交技术(FISH)检测3种细胞MYCN基因扩增情况.不同浓度13-cis RA作用后,采用相差显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附法测定细胞培养液神经元特异性烯醇化酶(NSE),细胞增殖毒性检测法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 13-cis RA作用后,3种细胞均伸出多个轴突树突状突起,呈极性化改变,出现细胞分化.FISH检测结果显示,SK-N-BE2细胞为MYCN扩增阳性,13-cis RA作用后MYCN仍扩增阳性,另2种细胞株未见扩增.3种细胞经不同浓度13-cis RA作用后NSE水平随药物作用时间延长而升高,其中SK-N-BE2细胞NSE水平显著升高,差异均有统计学意义(F =27.00,P＜0.000 1).13-cis RA作用48 h内均促进细胞增殖,随后转为抑制细胞生长.SH-SY5Y细胞经10 μmol/L 13-cis RA作用96 h及120 h显著增加细胞凋亡(F=16.21,P=0.011;F=16.04,P=0.016);SK-N-SH细胞经1μmol/L及10 μmol/L 13-cis RA作用48 h,细胞凋亡均显著增加(F=15.05,P=0.012;F=31.18,P=0.005);SK-N-BE2细胞经不同浓度13-cis RA(1 μmoL/L、5μmol/L、10 μmol/L)作用120 h细胞凋亡均显著增加(F=9.05,P=0.030;F=11.38,P=0.028;F=7.88,P=O.041).结论 13-cis RA体外能显著诱导NB细胞分化,作用48 h内促进细胞增殖,随后表现为抑制细胞生长,促进细胞凋亡. 13-cis RA对MYCN扩增阳性的细胞在DNA检测水平无改善,提示可能需要联合用药.
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三氧化二砷对3种神经母细胞瘤细胞株的诱导作用
目的 体外观察不同浓度三氧化二砷(As2O3)在不同的诱导时间作用下对3种神经母细胞瘤(NB)细胞株分化与凋亡的作用.方法 采用不同浓度(0、1、3、5、7 μmol/L)的As2O3诱导3组NB细胞株SK-N-SH、SK-N-BE2、SH-SY5Y,在同等条件下分别培养24、48、72 h.采用荧光原位杂交技术、流式细胞术、细胞增殖毒性检测法,检测As2O3对3种NB细胞株的细胞生物学影响.结果 5μmol/L As2O3诱导72 h后,SK-N-BE2的MYCN基因扩增数量明显减少;相较于低浓度(1μmol/L) As2O3,随着浓度的增加,3组细胞增殖活力逐渐降低,SH-SY5Y:24 h(chisq=9.666 7,P＜O.05),48 h(chisq=9.666 7,P＜0.05),72 h(chisq=9.512 8,P＜0.05);SK-N-SH:24 h(chisq=10.384 6,P＜O.05,),48 h(chisq=8.641 0,P＜0.05),72 h(chisq=9.461 5,P＜0.05),SK-N-BE2:24 h(chisq=8.435 9,P＜0.05),48 h(chisq=8.641 0,P＜O.05),72 h(chisq=9.545 5,P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示,随着As2O3浓度的增加,与空白组相比,细胞早晚期凋亡率明显增加,凋亡率分别为1.6％(0 μmoL/L),3.8％(1μmol/L),6.1％(3μmol/L),10.4％(5μmol/L),40.2％(7μmol/L);细胞周期中G2/M期延长,细胞分裂受到抑制.结论 1.As2O3对NB细胞株具有诱导凋亡,抑制细胞增殖的作用,呈剂量依赖性,不同类型的NB细胞株对As2O3敏感程度不一.2.SK-N-BE2细胞在As2O3诱导后,扩增的MYCN基因具有转阴趋势.3.经As2O3诱导后,3组NB细胞的细胞周期在S期及G2/M期受到阻滞,细胞核酸复制及细胞分裂受到抑制.
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化疗对神经母细胞瘤MYCN基因表达及其影响
目的:观察MYCN(N-myc)基因在神经母细胞瘤中的扩增及定位情况,探讨化疗对其表达的影响.方法;17例神经母细胞瘤病例,按Evans临床分期,其中6例术前接受化疗.用MYCN基因探针进行核酸原位杂交.MIAS-300图像分析系统对切片进行灰度扫描并作t'检验.结果:17例神经母细胞瘤标本中MYCN基因原位杂交检测阳性者11例(64.7%).MYCN基因定位于神经母细胞瘤细胞核内.临床分期对MYCN基因的表达无明显影响,而化疗对MYCN基因表达的影响作用明显.MYCN检测阳性与阴性组的术前VMA测定值也有显著性差异.结论:MYCN基因扩增反映神经母细胞瘤的疾病进程.化疗可抑制肿瘤细胞MYCN等胚胎性基因扩增.结合其临床VMA值的减低,表明肿瘤细胞的恶性行为受到抑制.
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MYCN与ALK基因相关靶向药在神经母细胞瘤治疗试验中的进展
神经母细胞瘤是儿童常见的颅外实体肿瘤.高危神经母细胞瘤患儿的治疗效果仍不理想,治疗失败的主要原因是耐药导致的复发和转移.靶向治疗具有特异性强、灵敏度高、毒副作用小等特点,是肿瘤治疗研究的新方向.本文主要对MYCN基因、ALK基因相关靶向药物在神经母细胞瘤治疗试验中的研究进展进行综述.
