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抑制Src酪氨酸激酶对非小细胞肺癌细胞外信号调节激酶影响的研究
目的:探讨抑制Src酪氨酸激酶活化对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞外信号调节激酶的影响及其作用.方法:采用NSCLC细胞株进行细胞培养,分别给予不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂.蚕白质印迹检测NSCLC细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化以及抑制Src酪氨酸激酶活化对NSCLC细胞ERK1/2磷酸化的影响.MTT法检测抑制Src酪氨酸激酶活化对NSCLC细胞体外增殖的影响.软琼脂糖集落形成实验检测抑制Src酪氨酸激酶对NSCLC细胞克隆形成的影响.结果:选用的NSCLC细胞都存在ERK1/2磷酸化.抑制Src酪氨酸激酶对PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化呈现浓度依赖性抑制作用,亚微摩尔水平Src酪氨酸激酶抑制剂几乎完全抑制PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化.Src酪氨酸激酶抑制剂对PC-9和A549细胞体外增殖表现出明显的浓度依赖性抑制作用(F=5.072,P=0.004；F=4.368,P=0.008).0.1、0.3和1.0 μmol/L的Src酪氨酸激酶抑制剂对PC-9和A549细胞增殖的抑制率分别为14.7％、47.1％、61.3％和19.8％、24.2％、30.6％.而其余3种NSCLC细胞ERK1/2磷酸化以及体外增殖对Src酪氨酸激酶抑制剂反应不敏感.Src酪氨酸激酶抑制剂明显抑制PC-9和A549细胞的克隆形成(t=11.746,P＜0.001；t=5.237,P＜0.001).结论:抑制Src酪氨酸激酶能够抑制PC-9和A549细胞ERK1/2磷酸化,从而抑制PC-9和A549细胞体外增殖.
关键词： Src酪氨酸激酶 癌 非小细胞肺 细胞外信号调节激酶1/2 增殖 -
Src酪氨酸激酶在人胃癌细胞转移中的作用和机制
背景与目的:Src酪氨酸激酶的活化在胃癌浸润和转移中发挥了重要的作用.本研究旨在探讨Src酪氨酸激酶对人胃癌细胞E-钙黏着蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、9表达、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌、转录因子NF-κ B和AP-1表达以及胃癌细胞体外侵袭能力的影响.方法:使用Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉(3和10 μmol/L)后,应用Western blot法检测人胃癌SGC7901细胞中E-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表达变化；应用实时PCR (real-time PCR)检测细胞中E-cadherin、MMP-2和MMP-9的mRNA表达变化；应用ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF表达变化；应用双荧光报告基因法检测NF-κB和AP-1转录活性；应用Transwell法检测肿瘤细胞侵袭能力变化.结果:当Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉浓度为3和10μmol/L时,SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达量显著增加,E-cadherin的mRNA表达是对照组的263.8％ (P＜0.05)和403.3％(P＜0.05);MMP-2和MMP-9的蛋白表达显著降低,MMP-2的mRNA表达是对照组的28.3％ (P＜0.05)和16.7％(P＜0.05),MMP-9的mRNA表达是对照组的23.6％ (P＜0.05)和13.3％(P＜0.05); VEGF含量是对照组的62.6％ (P＜0.05)和38.7％(P＜0.05)；AP-1转录活性是对照组的54.4％ (P＜0.05)和18％(P＜0.05),NF-κB转录活性是对照组的38.3％ (P＜0.05)和11.5％(P＜0.05)；胃癌细胞侵袭能力是对照组的43.3％ (P＜0.05)和28.2％ (P＜0.05),呈现明显的剂量依赖性抑制作用.结论:Src酪氨酸激酶活化与人胃癌SGC7901细胞体外转移能力密切相关,其机制可能与肿瘤转移相关基因表达有关.
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Eph/Ephrin-B1通过Src酪氨酸激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号抑制睫状神经节神经元的尼古丁乙酰胆碱受体电流
本研究旨在探讨Eph/Ephrin-B1信号对急性分离的鸡胚睫状神经节(ciliary ganglion,CG)神经元上α3-尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,α3-nAChRs)和α7-尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChRs)电流的影响及可能机制.用膜片钳技术在急性分离的CG神经元上分别记录α3-nAChRs和α7-nAChRs全细胞电流.为检测Ephrin-B1对细胞nAChRs电流的影响,细胞被随机分为:对照组、Ephrin-B1Fc处理组(用Ephrin-B1与IgG重组后形成的Ephrin-B1Fc刺激细胞)、IgG处理组(用与Ephrin-B1Fc处理组重组所需的相同浓度的IgG刺激细胞)和Ephrin-B1处理组(用与Ephrin-B1Fc处理组重组所需的相同浓度的Ephrin-B1刺激细胞).为探讨Ephrin-B1调节细胞nAChRs电流的机制,分别用Src信号抑制剂PP2和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号抑制剂PD98095预处理细胞后,再用Ephrin-B1Fc处理细胞,观察α3-nAChRs和α7-nAChRs电流的变化,细胞被随机分为:对照组、Ephrin-B1Fc处理组、PP2或PD98095(PP2/PD)处理组、Ephrin-B1Fc+PP2或PD98095处理组.结果显示:对照组、IgG处理组和Ephrin-B1处理组之间α3-nAChRs和α2-nAChRs电流无显著差异,而Ephrin-B1Fc处理组可显著抑制α3-nAChRs和α7-nAChRs电流,与对照组比较有显著差异(P=0.002、P=0.003);此外,PP2可部分恢复被Ephrin-B1Fc所抑制的α7-nAChRs电流,PD98095则可部分恢复被Ephrin-B1Fc所抑制的α3-nAChRs电流.以上结果提示,Eph/Ephrin-B1信号可能分别通过MAPK和Src信号途径抑制急性分离的CG神经元上α3-nAChRs和α7-nAChRs的电流,表明Eph/Ephrin-B1可能参与交感神经系统功能的调控.
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不同位点磷酸化Src酪氨酸激酶与食管鳞状细胞癌的关系
目的 探讨不同位点磷酸化Src酪氨酸激酶与食管鳞状细胞癌(ESCC)发生的关系.方法 收集30例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织块及3例新鲜食管鳞痛组织标本,培养人食管鳞癌TE1细胞株,分别采用免疫组织化学法、免疫印迹法和免疫荧光法分析食管鳞状细胞癌组织不同位点磷酸化Src酪氨酸激酶蛋白表达水平的变化.结果 免疫组织化学染色、免疫印迹和免疫荧光均显示食管鳞状细胞癌组织中Py416Src蛋白表达水平高于Py527Src,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 食管鳞状细胞癌组织中Py416Src蛋白高表达,Py527Src蛋白低表达,提示Src酪氨酸激酶不同位点磷酸化水平在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起重要作用.
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抑制Src酪氨酸激酶活性对人肺癌A549/DDP细胞耐药性及MDR1和LRP表达的影响
背景与目的 本研究旨在探讨抑制Src酪氨酸激酶活性对人肺癌A549/DDP细胞耐药性及多药耐药蛋白( muti-drug resistance 1,MDR1)和肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)表达的影响.方法 以Src酪氨酸激酶抑制剂作用于A549/DDP细胞,应用Western blot法检测肿瘤细胞Src酪氨酸激活性的变化,CellTiter-Glo发光法检测肿瘤细胞药物敏感性的变化,流式细胞仪检测肿瘤细胞Rh-123含量变化.Western blot法和RT-PCR检测肿瘤细胞MDR1和LRP表达变化.结果 Src酪氨酸激酶抑制剂可下调A549/DDP细胞中Src酪氨酸激活性,2.SμM和10 μM Src酪氨酸激酶抑制剂作用肿瘤细胞后,肿瘤细胞药物敏感性提高,逆转倍数(reversal fold,RF)分别为1.59倍和2.10倍,肿瘤细胞中 Rh-123含量分别提高了1.21倍和1.59倍,MDR1 mRNA表达分别是对照组的53.8％和27.5％,LRP mRNA表达分别是对照组的59.3％和21.4％,MDR1和LRP蛋白表达水平明显下降.结论 抑制A549/DDP细胞中Src酪氨酸激酶活性可逆转肿瘤细胞多药耐药性,提高肿瘤细胞药物敏感性,其机制可能与降低细胞MDR1和LPP表达有关
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Src蛋白在肺癌细胞增殖浸润中的作用
背景与目的 Src蛋自在肿瘤的发生、发展和转移中具有重要作用.本研究旨在探讨Src蛋白在肺癌细胞中的表达活化情况及其对肺癌细胞增殖浸润的影响.方法 采用Western blot和免疫沉淀法检测Src蛋自在肺癌细胞株中的表达和磷酸化情况;MTT法检测抑制Src酪酸激酶活化对肺癌细胞体外增殖的影响;Boyden chamber法检测抑制Src酪氨酸激酶活化对肺癌细胞体外侵袭浸润的影响.结果 本实验选用的肺癌细胞都存在pp60src的表达,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株Src蛋白的自主磷酸化水平(SrCPY418)明显增高,而人小细胞肺癌细胞株SBCS中几乎检测不到SrcpY418.抑制Src酪氨酸激酶活化对肺癌细胞体外增殖呈现出不同的反应,亚微摩尔Src蛋白酪氨酸激酶抑制剂对PC-9和A549细胞体外增殖表现出剂量依赖性抑制作用(P<0.05);而≤1μMSrc酪氨酸激酶抑制剂对H226、PC14PE6和RERFLCOK细胞增殖没有明显的抑制作用.Src酪氨酸激酶抑制剂对肺癌细胞体外侵袭浸润呈现明显的剂量依赖性抑制作用(P<0.05).结论 Src蛋白的活化,而不是过度表达,在NSCLC细胞体外增殖和浸润中发挥着重要作用.
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抑制Src酪氨酸激酶对小鼠肺转移癌的干预作用
目的:探讨抑制Src酪氨酸激酶对小鼠肺转移癌的干预作用及其机制.方法:采用雄性严重联合免疫缺陷(SCID )小鼠,敲除NK细胞,建立肺腺癌A549细胞诱导的实验性肺转移癌动物模型.每天给予小鼠口服Src酪氨酸激酶抑制剂,研究抑制Src酪氨酸激酶对实验性肺转移癌的影响;采用免疫组化法研究抑制Src酪氨酸激酶对转移瘤中增生指数(Ki67染色)和微血管密度(CD31染色)的影响.结果:A549细胞在肺表面形成弥漫性的转移性损伤,50mg/kg/d Src酪氨酸激酶抑制剂口服治疗组肺表面比对照组光滑,肺重量明显小于对照组和10mg/kg/d治疗组(P<0.05),而10mg/kg/d治疗组的肺重量和对照组相比没有明显差别.A549细胞接种后35天,对照组小鼠体重显著下降(P<0.01),而治疗组未见小鼠体重明显下降.口服Src酪氨酸激酶抑制剂 50mg/kg/d,明显减少肺组织内转移性肺损伤的数目和面积,同时显著减少Ki67阳性的增生性肿瘤细胞数(P<0.001).结论:抑制Src酪氨酸激酶通过抑制局部增殖和浸润抑制A549细胞诱导的肺转移癌.
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抑制Src酪氨酸激酶对非小细胞肺癌细胞VEGF表达的影响
目的:探讨抑制Src酪氨酸激酶对非小细胞肺癌细胞VEGF表达的影响.方法:采用ELISA法检测非小细胞肺癌细胞株培养上清中VEGF表达以及抑制Src酪氨酸激酶对VEGF表达的影响;采用雄性严重联合免疫缺陷(SCID )小鼠,敲除NK细胞,建立非小细胞肺癌细胞诱导的皮下肿瘤和实验性肺转移瘤动物模型,采用免疫组化法研究抑制Src酪氨酸激酶对皮下肿瘤和肺转移瘤中VEGF表达的影响.结果:本实验采用的3种非小细胞肺癌细胞都表达VEGF.0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L和3μmol/L Src酪氨酸激酶抑制剂对H226细胞VEGF表达的抑制率分别为18%、8%、24%和47%,对A549细胞VEGF表达的抑制率分别为14%、23%、50%和43%,对PC-9细胞VEGF表达的抑制率分别为25%、56%、51%和71%.抑制Src酪氨酸激酶明显抑制VEGF在肺转移瘤和皮下肿瘤中的表达.结论:抑制Src酪氨酸激酶能够抑制非小细胞肺癌细胞体外和体内VEGF的表达.
