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缺氧预处理后骨髓源神经干细胞联合脑源性神经生长因子移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的研究
目的：研究缺氧预处理后骨髓源性神经干细胞（source neural stem cels of bone marrow，BMSCs- NSCs）联合脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）立体定向移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的疗效，为高原地区脑梗死的细胞移植治疗提供动物实验基础。方法72只SD大鼠随机分为缺氧预处理组和常氧组，每组各36只，缺氧预处理组造模前3 d进行低氧预处理（hypoxic preconditioning，HPC）。两组均制作大脑中动脉阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。每组分为3个亚组（BMSCs-NSCs+BDNF组、BMSCs-NSCs组和对照组，每组各12只），分别梗死灶同侧尾状核内立体定向移植BMSCs-NSCs+BDNF、BMSCs-NSCs和DMEM/F12培养基。移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d进行神经功能缺损评分，每个时间点每组取2只大鼠，断头取脑后行免疫组织化学染色，观察5-溴脱氧尿嘧啶（5-Bromo-deoxyuridine，Brdu）阳性细胞的迁移路径，行CD133、Nestin、微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）、兔抗微管蛋白（β-tubulin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrilary acidic protein，GFAP）、半乳糖神经酰胺（Galactosylceramidase，Galc）免疫荧光染色，了解骨髓源性神经球分化情况。结果常氧BMSCs-NSCs+BDNF组、常氧BMSCs-NSCs组、缺氧预处理BMSCs-NSCs+BDNF组、缺氧预处理BMSCs-NSCs组7 d、14 d、21 d、28 d和35 d的神经功能评分均显著低于同组3 d时的神经功能评分。移植3 d时缺氧预处理对照组神经功能学评分显著低于常氧对照组（P=0.040）；移植7 d时缺氧预处理BMSCs-NSCs+BDNF组神经功能评分显著低于常氧BMSCs-NSCs+BDNF组（P=0.031）。无论缺氧预处理组还是常氧组，BMSCs-NSCs+BDNF组CD133、Nestin、MAP-2、β-tubul in、GFAP、Galc免疫荧光染色光密度值（integral optical density，IOD）均显著高于BMSCs-NSCs组（均P＜0.001）；BMSCs-NSCs+BDNF组、BMSCs-NSCs移植组各检测指标IOD均高于对照组（均P＜0.001）。结论大鼠缺氧预处理后BMSCs-NSCs联合BDNF立体定向移植可显著提高BMSCs-NSCs的效果。缺氧预处理并不能促进外源性BMSCs-NSCs分化，但却能明显改善大鼠神经功能。
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骨髓源神经干细胞对神经胶质瘤趋化性的研究
神经干细胞(NSCs)是具有增殖、迁移、分化等特点的原始神经细胞.对NSCs的临床期望主要集中在NSCs的替代治疗上,却较少关注其迁移性.我们通过分离纯化骨髓基质干细胞(BMSCs)并诱导分化为NSCs,通过多种途径注入到鼠脑胶质瘤模型,观察骨髓来源的NSCs对神经胶质瘤有无定向迁移性及其分布规律等.
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人酪氨酸羟化酶转染骨髓源神经干细胞获稳定表达的研究
我们通过本研究构建了表达人酪氨酸羟化酶(hTH)的荧光真核表达质粒pEGFP-C2-hTH,应用NucleofectorTM核转染方法将其转染至骨髓源性神经干细胞(NSCs-BM),TH基因在细胞内稳定表达,为进一步细胞移植治疗帕金森病(PD)提供可视化的TH基因修饰NSCs-BM.
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高海拔地区骨髓源神经干细胞及BDNF联合移植对大鼠脑缺血再灌注模型的治疗
目的 探讨高海拔地区大鼠骨髓源神经干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells,BMSCs-NSCs)及脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)联合移植对大鼠脑缺血再灌注模型的疗效及其相关机理.方法 60只Wistar雄性大鼠,置西宁地区正常饲养,制备大鼠脑缺血-再灌注损伤模型;模型制备完毕后立体定向下进行细胞移植治疗,将大鼠分为3组,即A组:大鼠骨髓源性神经球组(BMSCs-NSCs组,n=20);B组:大鼠骨髓源性神经球联合BDNF组(BMSCs-NSCs+BDNF组,n=20),注射大鼠骨髓源性神经球细胞的同时,联合注射100 ng BNDF;C组:对照组(仅注射DMEM/F12培养基,n=20);术后对其神经功能进行评定,并于术后24 d取脑组织,行Nestin、GFAP、Map2免疫荧光检测.结果 细胞移植后第3 d,各组间神经功能评分无显著性差异;细胞移植后第14 d BMSCs-NSCs+BDNF组神经功能评分显著优于BMSCs-NSCs组,BMSCs-NSCs组优于对照组;免疫组化检测发现,BMSCs-NSCS+BDNF组Nestin、GFAP、Map2的IOD值均显著高于BMSCs-NSCs组;BMSCs-NSCs+BDNF组、BMSCs-NSCs组各检测指标水平均高于对照组;Nestin、GFAP、Map2的表达主要集聚于脑梗死灶与正常脑组织交界处.结论 在西宁地区联合移植大鼠骨髓源神经干细胞及BDNF可显著促进大鼠大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型的神经功能恢复.
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GDNF对Nurr 1基因的大鼠骨髓源神经干细胞的诱导分化作用
目的:利用胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)对经过转染核相关因子1 (nuclear related factor 1, Nurr 1)基因的大鼠骨髓源神经干细胞(bone marrow stromal cells derived from neural stem cells,BMSCs-D-NSCs)进行培养和诱导分化,研究其能否促进Nurr 1-BMSCs-D-NSCs向多巴胺能神经元转化. 方法:(1)构建AAV-pcDNA3.1-Nurr 1载体;(2)诱导SD大鼠BMSCs分化为成熟的神经元样细胞;(3)用脂质体法转染Nurr 1基因到大鼠BMSCs-D-NSCs后用GDNF进行培养和诱导分化.结果:(1)AAV-pcDNA3.1-Nurr 1载体携带预期的Nurr 1遗传信息;(2)Nurr 1基因成功转染到BMSCs-D-NSCs中并且持续表达;(3)Nurr 1-BMSCs-D-NSCs以GDNF培养后表达TH因子. 结论:GDNF能促进经过转染Nurr 1基因的大鼠BMSCs-D-NSCs向多巴胺能神经元定向分化.
关键词： 胶质细胞系源性神经营养因子 核相关因子 骨髓源神经干细胞 -
Fasudil促进体外培养骨髓源神经干细胞的增殖与存活
目的 探讨法舒地尔(Fasudil)对体外培养骨髓源神经干细胞(BMNSC)增殖和存活的影响.方法 取3～4周龄的C57BL/6小鼠,分离骨髓基质细胞并诱导产生细胞球,用免疫荧光染色鉴定细胞类型.羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞,检测Fasudil促进BMNSC增殖能力.利用脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)联合处理BV-2小胶质细胞制备炎性条件培养液处理BMNSC,Fasudil干预,通过流式细胞术检测线粒体膜电位、碘化丙啶(PI)荧光值,探讨Fasudil对BMNSC的保护效果.结果 免疫荧光染色证明骨髓源细胞球为神经上皮干细胞蛋白(nestin)阳性的神经干细胞.Fasudil处理明显降低CFSE平均荧光值.在LPS和IFN-γ联合作用下,BV-2小胶质细胞释放更多的白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性细胞因子,显著高于PBS处理组.该炎性条件培养液导致BMNSC线粒体膜电位明显降低并诱导更多的细胞死亡,而Fasudil处理则显著恢复线粒体膜电位接近正常值,减少细胞死亡,并且具有明显的剂量依赖性.结论 Fasudil对体外培养BMNSC的增殖和存活具有显著的促进作用.
关键词： 法舒地尔(Fasudil) 骨髓源神经干细胞 线粒体膜电位 -
BDNF对大鼠骨髓源神经干细胞诱导分化的影响
目的 观察脑源性神经生长因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)对体外培养的Wistar大鼠骨髓源神经干细胞诱导分化的影响.方法 运用无血清培养基成功培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞,并对分离获得的悬浮生长的神经细胞球,运用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况.采用10％胎牛血清诱导其分化,并添加10 ng/mL BDNF,分化7d后,采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况.结果 大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中,呈悬浮状态生长,形成细胞球,经免疫荧光检测,细胞球表达CD133和Nestin.将细胞球转入含血清培养基分化7d后,表达GFAP的阳性细胞占61.78％±3.54％,Map2阳性细胞占6.28％±0.80％,β-tubulin Ⅲ阳性细胞占7.43％±1.09％,Galc阳性细胞占2.79％±0.62％.添加10 ng/mL BDNF后,表达GFAP的阳性细胞占62.76％±2.94％,Map2阳性细胞占14.29％±2.45％,β-tubulin Ⅲ阳性细胞占13.13％±2.42％,Galc阳性细胞占2.97％±0.82％.分别经两独立样本t检测,BDNF组分化为Map2及β-tubulin Ⅲ阳性细胞,显著高于血清组(P＜0.05),但BDNF组分化为GFAP及Galc阳性细胞与血清组相比,无显著性差异(P＞0.05).结论 BDNF可显著提高Wistar大鼠骨髓源神经干细胞分化为神经元的比例.
