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促凋亡蛋白Bim、Bax和Bak在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的表达
目的 建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型,检测成骨细胞凋亡过程中与Bcl-2蛋白相互作用的细胞死亡调解子(Bcl-2 interacting mediator,Bim)、Bcl-2蛋白相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)和Bcl-2蛋白拮抗剂(Bcl-2 antagonist/killer,Bak)的表达,探寻保护成骨细胞的方法,为牙周炎的发病机制研究提供依据.方法 提取牙龈蛋白酶并测定其活性；将0.453、0.906、1.812 U/L牙龈蛋白酶分别与成骨细胞共培养0、16、24和48 h,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染色检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)凋亡,建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型；1.812 U/L牙龈蛋白酶与成骨细胞共培养0、4、8、16、24和48 h,蛋白质印迹法确定成骨细胞凋亡过程中Bim、Bax、Bak的蛋白表达；胰蛋白酶抑制剂抑制1.812 U/L牙龈蛋白酶活性后与成骨细胞共培养24 h,蛋白质印迹法检测Bim蛋白表达与成骨细胞凋亡率的改变.结果 精氨酸-牙龈蛋白酶活性为(18.11±2.11) U/L,赖氨酸-牙龈蛋白酶活性为(1.02 ±0.25) U/L;DAPI染色显示1.812 U/L牙龈蛋白酶可诱导成骨细胞凋亡,16h凋亡率为(6.31±0.37)％,24 h达(11.20 ±0.35)％,48 h为(10.80±0.46)％；膜联蛋白V-碘化丙啶染色结果与DAPI染色结果基本一致.成骨细胞凋亡过程伴随促凋亡蛋白Bim的表达升高,4h时Bim相对蛋白表达量为(0.31 ±0.03),约为对照组(0.17 ±0.03)的2倍,24 h时Bim相对蛋白达峰值(0.57 ±0.05),为对照组的3～4倍；胰蛋白酶抑制剂可有效抑制牙龈蛋白酶活性,使Bim蛋白表达量由(0.58±0.04)降至(0.14±0.03)；同时DAPI染色显示胰蛋白酶抑制剂可逆转牙龈蛋白酶诱导的细胞凋亡,24 h成骨细胞凋亡率由(11.20±0.35)％降至(4.31±0.38)％.成骨细胞高表达Bax(相对蛋白表达量为0.85±0.05),在成骨细胞凋亡过程中,Bax的相对蛋白表达总量无明显改变；蛋白质印迹法未检测到成骨细胞表达Bak.结论 1.812 U/L牙龈蛋白酶可诱导成骨细胞凋亡,凋亡过程中伴随Bim表达升高,抑制牙龈蛋白酶活性可有效降低Bim的蛋白表达,提示促凋亡蛋白Bim参与牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程,抑制Bim的表达可使成骨细胞免于凋亡.
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牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中对整合素α5、β1表达的影响
目的 探讨牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中对整合素α5、β1的调节机制,为牙周炎发病机制的研究提供理论依据.方法 标准厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌W83,分离提纯牙龈蛋白酶.用8.348 U/L牙龈蛋白酶处理小鼠成骨细胞MC3T3-E1 48 h,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法-4’,6-二脒基-2-苯基吲哚[transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotinnick end labeling-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,TUNEL-DAPI]双染色法检测细胞凋亡；蛋白质印迹法检测整合素α5、β1蛋白的表达水平.结果 精氨酸-蛋白酶活性为(41.74±2.11) U/L,赖氨酸-蛋白酶活性为(1.02±0.25)U/L.TUNEL-DAPI染色显示牙龈蛋白酶作用于MC3T3-E1细胞48 h后诱导细胞发生凋亡.在短时间内(≤72 h)牙龈蛋白酶呈时间依赖性下调整合素α5、β1的表达水平,48 h时整合素α5、β1相对表达量分别为(0.485±0.039)、(0.504±0.002),72 h时分别为(0.398±0.058)、(0.179±0.001),与对照组(蛋白相对表达量分别为1.000±0.000、1.000±0.000)相比差异均有统计学意义(P ＜0.05)；72 h后,整合素α5表达水平与对照组相比差异无统计学意义,但整合素β1仍持续下调(96、120 h时相对表达量分别为0.604±0.003、0.357±0.002),均显著低于对照组(1.000±0.000) (P＜0.05).牙龈蛋白酶特异性抑制剂甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(tosyl-CL-clysine-chloromethyl-ketone,TLCK)可有效抑制蛋白酶活性,使整合素α5、β1蛋白表达量分别从(0.398±0.058)、(0.179±0.001)显著上升至(0.781±0.012)、(0.857±0.060)(P＜0.05),但TLCK本身不改变整合素α5、β1的表达水平(P＞0.05).同时牙龈蛋白酶还呈剂量依赖性下调整合素α5、β1的表达水平,20.8700 U/L牙龈蛋白酶作用下整合素α5、β1相对表达量达低值(0.105±0.004、0.020±0.000),与对照组(1.000±0.000)相比差异有统计学意义(P＜0.05).牙龈蛋白酶直接处理成骨细胞膜蛋白提取物,与对照组相比各组间整合素α5、β1相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05),提示牙龈蛋白酶不直接降解整合素α5、β1.结论 牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中呈时间和剂量依赖下调整合素α5、β1的表达,下调途径不是通过该蛋白酶的直接蛋白水解发挥作用.
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牙龈卟啉单胞菌W83牙龈蛋白酶的提取、鉴定及对人成骨细胞增殖、凋亡的影响
目的 研究提纯并鉴定牙龈卟啉单胞菌(P.g)W83 牙龈蛋白酶的方法,探讨牙龈蛋白酶对人成骨细胞系hFOB 增殖及凋亡的影响.方法 丙酮沉淀P.g W83 上清,经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白酶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离牙龈蛋白酶条带;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/源后衰变法(MALDI-TOF-MS/MS+MS)鉴定牙龈蛋白酶提取物;底物发色法测定牙龈蛋白酶活性;牙龈蛋白酶与人成骨细胞系hFOB 1.19共培养,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或CCK-8 检测细胞凋亡或增殖.结果 P.g W83 牙龈蛋白酶提取物经SDS-PAGE 分离出50 kDa 蛋白条带,MALDI-TOF-MS/MS+MS 鉴定其为精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Rgps).底物发色法测定Rgps、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Kgp)活性分别为75.62、10.51 U/L,5 mmol/L 半胱氨酸蛋白酶抑制剂TLCK 对Rgps、Kgp 活性抑制分别为99.51%、99.00%(P ＜ 0.01).牙龈蛋白酶(Rgps 活性15.12 U/L、Kgp 活性2.10 U/L)与hFOB 共培养8 h 可诱导细胞发生凋亡,出现典型的细胞核染色质凝聚,且随时间增加hFOB 凋亡率逐渐上升,16 ～ 24 h 达到高峰.CCK-8 法检测显示,牙龈蛋白酶呈时间依赖性抑制hFOB 增殖.结论 丙酮沉淀P.g W83 上清,经重悬、透析、超滤提纯的牙龈蛋白酶主要成分是Rgps;底物发色法测定Rgps/Kgp 活性,方法稳定、可靠;牙龈蛋白酶抑制hFOB增殖且促进凋亡.
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整合素β1介导牙龈蛋白酶所致的小鼠成骨细胞周期阻滞
目的 探讨整合素β1(Itgb1)在介导牙龈蛋白酶所致的小鼠成骨细胞周期阻滞中的作用.方法 8.348 U/L牙龈蛋白酶处理MC3T3-E1细胞12、24、36、48、60、72 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖活性,含核糖核酸的碘化丙啶(PI/Rnase)染色检测细胞周期G0/G1、S、G2/M各期分布.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测cyclin D1和CDK4蛋白表达水平.携带Itgb1基因的慢病毒转染MC3T3-E1细胞,构建Itgb1过表达稳转细胞株.所有数据采用SPSS 22.0统计软件包进行统计学分析.结果 CCK-8结果 显示,8.348 U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞12～72 h持续抑制细胞增殖.流式检测结果 发现,牙龈蛋白酶作用细胞12 h,停滞在G0/G1期的细胞比例由对照组(62.0±2.0)％升至(88.2±2.3)％,差异有统计学意义(F=35.218,P<0.001),S期细胞比例由对照组(36.8±6.2)％降至(5.9±2.3)％,差异有统计学意义(F=33.980,P<0.001).Western blot结果 表明,cyclin D1和CDK4的蛋白表达水平与对照组相比分别下调了65.0％(Fcyclin D1=60.294,Pcyclin D1<0.001)和40.3％(FCDK4=19.212,PCDK4=0.002).同时牙龈蛋白酶降低Itgb1表达,过表达Itgb1部分逆转牙龈蛋白酶所致的细胞周期阻滞,S期细胞比例由牙龈蛋白酶处理空载体组的(5.8±1.1)％恢复至(14.4±3.1)％,差异有统计学意义(F=39.226,P=0.017),cyclin D1和CDK4蛋白下调水平亦得到部分逆转(Fcyclin D1=61.740,Pcyclin D1=0.033;FCDK4=41.635,PCDK4=0.014).结论 Itgb1介导牙龈蛋白酶所致的小鼠成骨细胞细胞周期阻滞.
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牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表达改变
目的:检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中Bad的表达改变,为保护成骨细胞提供依据.方法:8.348U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞0、4、8、16、24、48和72h,或将不同浓度牙龈蛋白酶与成骨细胞作用24h后,蛋白质印迹法检测Bad蛋白表达改变.结果:在一定范围内,牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中呈时间和剂量依赖性上调Bad的表达,牙龈蛋白酶抑制剂TLCK有效抑制牙龈蛋白酶所诱导的Bad的高表达.结论:牙龈蛋白酶上调Bad的表达,促凋亡蛋白Bad参与了牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程.
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BMP-7在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的保护作用
目的:研究牙龈蛋白酶对成骨细胞MC3T3-E1的增殖及凋亡的作用,以及BMP-7在此过程中的保护作用.方法:分离提纯牙龈蛋白酶,建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型,使用MTT法、TUNEL/DAPI染色法检测牙龈蛋白酶对成骨细胞增殖及凋亡的影响,并且研究BMP-7对于牙龈蛋白酶造成的细胞凋亡的保护作用.结果:牙龈蛋白酶呈剂量和时间依赖性地抑制成骨细胞增殖,诱导成骨细胞凋亡.在500和1000 ng/ml浓度范围内,BMP-7呈剂量依赖性地减轻牙龈蛋白酶对成骨细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用.结论:BMP-7能有效抵抗牙龈蛋白酶诱导产生的成骨细胞增殖抑制及细胞凋亡.
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牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中的作用及对Bim、整合素α5的影响
目的：探讨牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡的作用及对与Bcl-2蛋白相互作用的细胞死亡调节子( Bim)蛋白、整合素ɑ5的影响。方法分离并提取牙龈蛋白酶,测定其活性,实验分为两组,其中实验组采用浓度为1.812 U/L的牙龈蛋白酶处理小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)48 h,对照组采用牙龈蛋白酶特异性抑制剂(TCLK)对牙龈蛋白酶进行预处理,采用TUNEL-DAPI法测定两组MC3T3-E1细胞的凋亡率,采用免疫印迹法测定不同时间两组Bim蛋白、整合素ɑ5表达变化。结果实验组牙龈蛋白酶中精氨酸牙龈蛋白酶( Rgp)、赖氨酸牙龈蛋白酶( Kgp)的活性均显著高于对照组(P<0．01)；在0 h,两组MC3T3-E1细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0．05),在第16、24、48 h实验组的MC3T3-E1细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0．05)；在第8、16、24、48 h实验组的Bim蛋白表达均显著高于本组0 h(P<0．05),在第24 h时达到高值,同时也显著高于对照组(P<0．05)；在第16、24、48 h实验组的整合素ɑ5表达较本组0 h均显著降低( P<0．05)；同时显著低于对照组( P<0．05)。结论牙龈蛋白酶能成功诱导成骨细胞凋亡,这一作用机制可能与增强Bim蛋白表达、下调整合素ɑ5表达有关。
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整合素在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制
目的 探讨整合素α5、β1在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制.方法 厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌,分离牙龈蛋白酶.用6.840 U/L的牙龈蛋白酶处理人颅骨成骨细胞(HCO)48 h,生物素原位缺口末端标记法(TUNEL)-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光双染色法检测细胞凋亡情况;Western印迹检测不同牙龈蛋白酶浓度和不同作用时间HCO中整合素a5、β1蛋白表达变化;用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制剂LY294002处理HCO后观察不同时间点整合素a5、β1蛋白表达变化.结果 TUNEL-DAPI染色显示,牙龈蛋白酶作用48 h后阳性对照组及观察组HCO凋亡的细胞数目较空白对照组明显增多.与空白对照组相比,牙龈蛋白酶可明显下调HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平,且随浓度增加逐渐增强,各浓度之间差异有统计学意义(P<0.05).随着牙龈蛋白酶作用时间延长,HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平逐渐下调,各时间点之间差异均有统计学意义(P<0.05);整合素β1蛋白表达水平降低程度明显大于整合素α5,牙龈蛋白酶作用16 h、24 h、48 h、72 h时整合素β1蛋白表达水平均明显低于同期整合素α5,差异有统计学意义(P<0.05).LY294002处理HCO后,各时间点整合素α5、β1蛋白表达水平之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 牙龈蛋白酶通过PI3K-AKT信号通路下调整合素α5、β1表达来诱导人成骨细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性.
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牙龈卟啉单胞菌PG1055基因在临床菌株中的表达
目的 应用基因芯片技术检测PG1055基因在不同人群的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)中分布,探讨这些基因与牙周临床指数之间的关系.方法 取龈下菌斑进行细菌分离培养,以临床采集样本提取的DNA为探针,以抑制消减杂交技术获得P.gingivalis W83的特异基因片段PG1055为目标序列,采用Cy5荧光标记目标序列.应用基因芯片技术检测PG1055基因在牙周病患者及健康人群的牙龈卟啉单胞菌中的分布.结果 PG1055基因在牙周病患者及健康人群中的检出率有统计学差异,并且与牙周临床指数相关.结论 PG1055基因与P.gingivalis的致病性有关.
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PMX205抗炎作用的体外研究
目的:探讨补体C5a受体拮抗剂PMX205的体外抗炎作用.方法:MTT法检测PMX205对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的毒性.RAW264.7与牙龈蛋白酶(gingipain,G)体外共培养模拟炎症环境,观察PMX205的抗炎效果.实验分为6组:阴性对照组、G组、G+PMX205 (0.1、1、5、10 mg/L)组,24 h后qRT-PCR、ELISA法检测M1型巨噬细胞标志性细胞因子IL-6及TNF-α,M2型标志性细胞因子IL-10和TGF-β1;流式细胞术检测M1型标志性分子CD86及M2型标志性分子CD206.结果:MTT结果显示,PMX205对RAW264.7活力影响较小.qRT-PCR及ELISA结果显示,G组IL-6和TNF-α表达水平较阴性对照组增加;G+ PMX205各浓度组的IL-6和TNF-α的表达水平较G组减少,TGF-β1和IL-10表达水平均较G组增加(P＜0.01或P＜0.05).流式细胞术结果显示,G组CD86阳性率增加,CD206阳性率下降,G+PMX205组较G组CD86下降,而CD206增加.结论:在体外细胞模型实验中PMX205具有良好的抗炎作用.
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牙龈蛋白酶对M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的调控作用
目的:探讨牙龈蛋白酶对M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的调控作用.方法:采用sheets改良法从PgATCC 33277培养物上清中制备牙龈蛋白酶,应用质谱法鉴定牙龈蛋白酶,底物发色法测定酶活性,鲎试剂检测牙龈蛋白酶中LPS残留量.体外细胞模型实验评价牙龈蛋白酶对大肠杆菌脂多糖(Ec-LPS)诱导的M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子的影响.实验分为3组:阴性对照组、Ec-LPS组和Ec-LPS+牙龈蛋白酶组,采用qRT-PCR和ELISA法检测M1型巨噬细胞表达的抑菌细胞因子白细胞介素12(IL-12)、一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素10(IL-10)在基因和蛋白水平的表达情况.结果:制备的牙龈蛋白酶为RgpA,活性20 U/L,LPS残留量＜0.01EU/mL.qRT-PCR和ELISA结果显示,与阴性对照组相比,Ec-LPS组IL-12和iNOS基因和蛋白的表达水平明显升高,IL-10的表达降低,即成功诱导M1型巨噬细胞,组间有显著差异(P＜0.01);Ec-LPS+牙龈蛋白酶组IL-12、iNOS和IL-10基因和蛋白的表达较Ec-LPS组显著降低,但高于阴性对照组,组间有显著差异(P＜0.01).结论:牙龈蛋白酶具有抑制M1型巨噬细胞表达抑菌细胞因子IL-12、iNOS的作用.
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牙龈卟啉单胞菌的研究进展
牙龈卟啉单胞菌( Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis)是牙周感染重要的致病菌,与慢性牙周炎的发生发展密切相关。其致病性归因于一系列毒力因子如菌毛、荚膜、脂多糖、牙龈蛋白酶等。相关毒力因子的致病机制引起了国内外学者的广泛关注和重视。本文就牙龈卟啉单胞菌表面结构菌毛、荚膜及菌体分泌脂多糖、牙龈蛋白酶等重要致病因子的致病机制研究进展做一综述,以期为牙周炎的防治提供新的靶点和思路。
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牙龈卟啉菌蛋白酶的结构和作用
牙龈蛋白酶是牙龈卟啉菌的主要致病因子,因其对宿主蛋白的广泛活性受到了普遍关注.本文就牙龈蛋白酶的生化特征、基因结构、蛋白分子结构与作用的研究现状作一综述.
