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分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因的表达与鉴定
目的:在耻垢分枝杆菌中表达预测的噬菌体D29裂解酶基因片段,鉴定其细胞壁裂解活性.方法:在分析分枝杆菌噬菌体D29开放阅读框序列的基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后,在耻垢分枝杆菌中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养重组菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性.结果及结论:成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,降解宿主菌细胞壁,证实gene10表达产物为噬菌体裂解酶,并推测其为非经典分泌蛋白.
关键词： 裂解酶 分枝杆菌噬菌体D29 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 -
人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达
目的 构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒.并在耻垢分枝杆菌中进行表达.方法 PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆人pET32a(+)质粒.鉴定正确后,冉亚克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585 bp的UreI基因片段.重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定.与预期结果一致.目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达.
关键词： 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 幽门螺杆菌 尿素通道蛋白 耻垢分枝杆菌 -
表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达
目的 建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase chain teaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性.结果 从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528 bp的基因片段.所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Western blot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性.结论 成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒.该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达.
关键词： 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 幽门螺杆菌 OMP 耻垢分枝杆菌 -
表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究.方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中.以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数.结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P＜0.05).结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础.
关键词： ESAT-6 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒 重组耻垢分枝杆菌 巨噬细胞
