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用染色体畸变研究AT细胞系辐射敏感性和适应性反应
目的探讨毛细血管扩张运动共济失调症(ataxia telangiectasia,AT)细胞系的辐射敏感性和对低剂量辐射能否诱导细胞遗传学适应性反应.方法用2 cGu60Co γ射线预先照射进入G1期的AT5B1VA(AT)细胞和GM0639(GM)细胞,培养6 h后再照射1.0Gy或3.0Gy60Co γ射线,分析染色体畸变.结果G1期的GM细胞在预照射2 cGy 60Coγ射线的诱导剂量后能非常显著地降低随后照射1.0 Gy或3.0Gy60Coγ射线诱发的染色体畸变率,染色体畸变的观察值非常显著地低于预期值(P＜0.001),而对AT细胞则没有观察到这种现象,染色体畸变的观察值与预期值差异无统计学意义(P＞0.05);另外,1.0Gy或3.0Gy60Coγ射线诱发AT细胞的各种畸变率(包括着丝粒畸变、无着丝粒畸变和染色单体型畸变)均显著地高于GM细胞(P＜0.001).结论低剂量电离辐射不能诱导AT细胞产生细胞遗传学适应性反应;AT细胞对电离辐射诱发染色体畸变高度敏感,可能是由于不能正确修复DNA双链断裂的结果.
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ATM基因对60Coγ射线照射后AT细胞hTERT表达的影响
目的研究外源性ATM基因对电离辐射照射的毛细血管扩张-共济失调症(ataxiatelangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞(AT5BIVA)hTERT mRNA和蛋白表达的影响.方法以正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照,应用RT-PCR与Western blot实验方法,观察经0、1、3和5Gy(剂量率1.0 Gy/min)60Co γ射线照射后,AT细胞、空载体AT细胞、ATM+-AT细胞和GM细胞的hTERT mRNA和蛋白表达的变化.结果未照射时,除GM细胞外,其余各细胞均有hTERT mRNA和蛋白的表达;ATM+-AT细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量较AT细胞明显下降(P＜0.05);ATM+-AT细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量仍然明显高于GM细胞的hTERT mRNA表达量.在1～5 Gy剂量范围内,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的hTERT mRNA和蛋白表达量呈剂量依赖性增加;在相同照射剂量点,ATM+-AT细胞的hTERT mRNA表达量较AT细胞均有明显降低(P＜0.05).结论电离辐射可诱导细胞hTERT mRNA和蛋白的表达;并且细胞hTERT mRNA和蛋白表达量呈剂量依赖性增加;外源性ATM基因可下调AT细胞hTERT mRNA和蛋白的表达.推测端粒酶参与电离辐射诱导DNA损伤的修复.
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AT细胞系辐射敏感性与细胞凋亡的相关研究
目的 探讨AT细胞高辐射敏感性与细胞凋亡之间的联系.方法 以液体闪烁测量法测3H-TdR掺入百分率来观察60Co γ射线照射对AT5BIVA(AT)和GM0639(GM)细胞增殖的影响;实验于照射后0、24、48和72 h,用细胞流式术动态检测AT和GM细胞的自发凋亡率及60Co γ射线照射诱发的凋亡率.结果 60Co γ射线0～6 Gy照射后,AT和GM两种细胞3H-TdR掺入百分率均呈剂量依赖性降低,且AT细胞降低得比GM细胞快,两种细胞3H-TdR掺入百分率与受照射剂量间可拟合成指数方程:SAT=0.9718e-0.6855D(R2=0.9950)、SGM=1.0928e-0.3731D(R2=0.9777);AT细胞的自发凋亡率高于GM细胞;2～6 Gy照后24 h,两种细胞由辐射诱发的凋亡率均随照射剂量增大而升高,且在同一剂量点,前者凋亡率高于后者;2 Gy照射后0～72 h,AT和GM细胞的凋亡率均呈时间依赖性增加,且随照后时间延长两者间差异逐步增大,在72 h达到显著水平.结论 AT细胞高辐射敏感性与其较高的自发及辐射诱发的凋亡密切相关.
关键词： AT细胞 细胞辐射敏感性 3H-TdR掺入百分率 凋亡率 -
ATM对辐射后AT细胞端粒酶活性的影响
目的:探讨ATM对电离辐射照射的毛细血管扩张-共济失调症(ataxia telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞(AT5BIVA)端粒酶活性的影响.方法:以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照,应用基于PCR的端粒重复扩增技术(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)与高效液相色谱(HPLC)技术,定量分析细胞分别经0、1、3、5 Gy60Coγ射线照射后以及经3 Gy60Coγ射线照射后继续培养2、24、48、72 h,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性的变化.结果:未照射时,除GM细胞外,AT、空载体AT、ATM+-AT细胞均呈现较高的端粒酶活性表达,但ATM+AT细胞的端粒酶活性明显低于AT和空载体AT细胞的端粒酶活性(P＜0.01),而后二者无明显差异(P＞0.05);电离辐射照射后,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性均呈剂量依赖性和时间依赖性增强,且在相同剂量点与时间点,ATM+-AT细胞的端粒酶活性高于GM细胞(P＜0.01)(除5 Gy计量点外),但低于AT和空载体AT细胞(P＜0.01),而后二者无明显差异(P＞0.05).结论:电离辐射可诱导细胞端粒酶活性表达;并且细胞端粒酶活性水平随剂量与时间的增加而增加;ATM可下调AT细胞端粒酶活性水平.推测端粒酶参与电离辐射诱导DNA损伤的修复.
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时间因素对电离辐射后AT细胞hTERT mRNA表达的影响
目的 研究时间因素对电离辐射后共济失调性毛细血管扩张(ataxia telangiectasia, AT)综合征患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞 (AT5BIVA)hTERT mRNA表达的影响.方法 以源于正常人皮肤的成纤维细胞系 GM细胞(GM0639)为对照,细胞经5 Gy(剂量率1.0 Gy/min) 60Co γ射线照射后继续培养2、24、48、72 h,应用RT-PCR法,观察AT细胞、ATM+-AT细胞和GM细胞的hTERT mRNA表达的变化.结果 照射后细胞hTERT mRNA的表达随培养时间的增加而增加;AT细胞hTERT mRNA的相对表达量高于ATM+-AT细胞和GM细胞(P＜0.05),后两者无显著性差异(P＞0.05).结论 电离辐射能诱导细胞hTERT mRNA的持续表达;ATM能下调AT细胞hTERT mRNA的表达.
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ATM与辐射激活的磷酸化P53、P21蛋白的相互作用
背景与目的:ATM基因属于PI-3K激酶家族成员,其编码蛋白具有调控DNA修复过程和调整细胞周期关卡的功能.毛细血管扩张性共济失调症(ataxia-telangiectasia,AT)患者AT细胞中ATM基因的突变导致了辐射诱发的P53、P21磷酸化缺失,说明辐射激活ATM基因可调控P53、P21的磷酸化.本实验利用免疫共沉淀及Western blot技术来研究辐射激活的ATM基因与p53的关系,并观察ATM基因是否不通过P53而直接调控P21的磷酸化.方法:利用电穿孔技术将含有ATM基因cDNA的真核表达载体pEBS7-YZ5转染到AT细胞中,用潮霉素筛选以获得稳定表达细胞株,RT-PCR检测ATM cDNA的转录以进一步验证;在ATM稳定表达的AT细胞中,利用免疫共沉淀及Western blot技术研究ATM基因与p53基因的相互关系;以K562细胞(p53突变)为p53突变细胞模型,研究ATM是否直接磷酸化P21.结果:pEBS7-YZ5成功转进AT细胞,RT-PCR检测到ATMcDNA片段;ATM稳定表达的AT细胞株在电离辐射诱导下,P53被磷酸化,免疫共沉淀显示ATM与P53相互作用;K562细胞经60Co γ射线照射后,P21被磷酸化,ATM抗体免疫共沉淀物中检测到P21蛋白的存在.结论:细胞遭受电离辐射作用后所激活的ATM激酶,可通过磷酸化P53继而活化细胞周期检控点P21蛋白,也可在电离辐射导致DNA损伤早期直接磷酸化P21蛋白,来启动DNA修复机制.
