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伤寒沙门菌sufC基因缺陷变异株的制备
目的 为深入研究sufC基因在伤寒沙门菌中的功能作用,制备sufC基因缺陷变异株.方法 根据GeneBank公布的伤寒沙门菌sufC基因序列,设计sufC缺失用PCR特异性引物,制备缺失sufC基因的同源性核苷酸片段,连接自杀质粒后导入伤寒沙门菌野生株,诱导同源重组,重组菌经PCR观察及序列分析鉴定,将完全重组稳定的相应菌株作为伤寒沙门菌sufC基因缺陷变异株,并经测序分析加以确定.结果 PCR及序列分析证实,缺陷变异株的sufC基因缺失495个碱基.结论 伤寒沙门菌sufC基因缺陷株构建成功,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能作用奠定了基础.
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伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备
目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株.方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶Bgl Ⅱ位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用Bgl Ⅱ消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段.将此片段胶回收后并导入自杀质粒pGMB151的BamH Ⅰ位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基.结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.
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伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株的制备
目的: 为探讨z66鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的fljA样基因的功能,制备沙门菌 fljA样基因缺陷变异株.方法: 根据伤寒沙门菌fljA样基因序列,设计PCR特异性引物并在5'-末端加接酶BglII位点,扩增fljA样基因上、下游片段,用BglII消化后,定向连接成fljA样基因的缺损性同源性核苷酸片段,先克隆至pGEM-T质粒,再经BamHI酶切后导入自杀质粒pGMB151,电转化入伤寒沙门菌(GIFU 10007),进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为fljA样基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果: PCR及序列分析证实,缺陷变异株的fljA样基因缺失231个碱基.结论: 成功构建伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌鞭毛抗原表达的调控作用奠定了基础.
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鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株的制备
目的:为进一步研究鼠伤寒沙门菌毒力基因spvC的功能,制备鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株.方法:根据鼠伤寒沙门菌spvC基因序列,设计PCR特异性引物,制备spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段,导入自杀质粒pCVD442后再导入鼠伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为spvC基因的缺陷变异株,并通过核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的spvC基因缺失711个碱基.结论:成功构建鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株,为进一步研究其在鼠伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.
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伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株的制备及其生存能力
目的 为深入研究rpoE基因在伤寒沙门菌侵袭致病中的作用,制备rpoE基因缺陷变异株;观察rpoE基因缺陷变异株在应激条件下的生存能力.方法 根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,制备rpoE基因缺陷性同源性核苷酸片段导入自杀质粒PGMB151后再导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象;绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在应激条件下的生存情况.结果 PCR及序列分析证实,缺陷变异株的rpoE基因缺失288个碱基;生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在氧、酸、高渗应激条件下生存能力明显低于野生株,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,并发现在氧、酸、高渗应激条件下其生存能力明显降低,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.
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鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷变异株的制备及其抗酸能力检测
目的：为深入研究鼠伤寒沙门菌毒力基因 spvB的功能，制备鼠伤寒沙门菌 spvB基因完全缺陷变异株，观察spvB基因缺陷株在体外酸性环境中的生存能力。方法根据鼠伤寒沙门菌spvB基因序列，设计PCR特异性引物，制备spvB基因缺陷性同源性核苷酸片段，导入自杀质粒 pCVD442后再导入鼠伤寒沙门菌野生株，进行同源重组，用 PCR方法观察重组现象，将完全重组的菌株作为 spvB基因的缺陷变异株，并通过核苷酸序列分析加以确定。绘制生长曲线，对比 spvB基因缺陷变异株与野生株在酸性条件下的生存情况。结果 PCR 及序列分析证实，缺陷变异株的 spvB基因缺失1749 bp。酸性条件下培养1 h及2 h后，野生株的活菌数高于spvB基因缺陷株，差异有统计学意义(P<0.05)；且野生株在酸性环境中的生存率明显高于缺陷株，野生株在1 h 及2 h 后的生存率分别为85.6%、74.9%，缺失株分别为68.0%、42.3%。结论成功构建鼠伤寒沙门菌 spvB基因缺陷变异株，并发现在酸性条件下其生存能力明显降低，为进一步研究其在鼠伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。
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伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株制备与分泌蛋白初析
目的观察伤寒沙门菌调节蛋白OmpR的调节作用,制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,并比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在不同渗透压环境培养下的分泌蛋白.方法用自杀质粒pGMB151介导同源性重组方法制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,用PCR方法观察重组现象,变异株经测序和外膜蛋白的SDS-PAG电泳鉴定,用SDS-PAG电泳结合Western blot比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在高、低渗透压环境培养下的SipC等分泌蛋白.结果成功制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株,并发现变异株中,包括SipC、鞭毛素蛋白在内的多种蛋白的表达分泌有明显差异.结论伤寒沙门菌OmpR在不同的渗透压下分别影响SipC、鞭毛素蛋白等多种蛋白的表达分泌.
