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E2F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞中的表达研究
目的 研究E2 F2在类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞(RA FLs)中的表达,分析其表达与类风湿关节炎病理特征的关系,以及调控E2F2表达的机制.方法 采用瞬时转染的方法将E2F2 siRNA转染入RA FLs后,应用RT-PCR法筛选干扰效率高的siRNA,并应用MTS法检测干扰E2 F2表达后对RA FLs增殖的影响,采用ELISA法检测E2 F2下游基因表达的变化.采用RT-PCR法检测分别使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs以及共同使用TNF-α和PDTC刺激RA FLs后E2 F2的表达.通过染色质免疫沉淀法(ChIP)检测调控E2F2表达的方式.结果 在siE2F2后,与对照组相比E2F2在mRNA水平表达显著降低(P＜0.01),细胞增殖能力减弱(P＜0.05).在RA FLs中TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达.结论 在RA FLs中E2 F2存在高表达现象,并且E2 F2的高表达参与RA的病变过程,TNF-α通过NF-κB信号通路调控E2F2表达,可做为治疗类风湿关节炎的新靶点.
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RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定
目的:改良体外分离、培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的方法,并进行鉴定.方法:取关节镜手术中获得RA患者滑膜组织进行机械分离、胶原酶消化后直接将所有消化产物置于细胞培养皿两次贴壁培养,差速消化法纯化成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术及免疫细胞化学的方法鉴定细胞纯度.结果:胶原酶消化后直接贴壁结合差速消化纯化法分离获得的原代滑膜细胞中呈梭形的成纤维样细胞占98％以上,细胞核呈椭圆形位于细胞中央,偶见少量圆形的滑膜巨噬细胞.流式细胞术显示98％以上的滑膜细胞具有vimeintin+ CD68的成纤维细胞特征.免疫细胞化学提示滑膜细胞vimentin表达阳性、CD68不表达.结论:成功分离获得了纯度和活性很高的人滑膜成纤维样细胞,方法更简便,效率更高,为后续类风湿性关节炎滑膜侵袭机制的研究奠定了基础.
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TNF-α对类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细胞RUNX3表达的影响及意义
目的 探讨TNF-α对类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细胞RUNX3表达的影响及意义.方法 从类风湿性关节炎患者滑膜组织中分离并培养原代成纤维细胞,加入不同浓度(0、0.1、1、10、50 ng/mL)TNF-α分别作用0、3、6、12、24 h,采用实时荧光定量PCR法检测RUNX3 mRNA相对表达量.取传3～8代成纤维细胞,随机分为RUNX3过表达组和对照组,分别感染人源RUNX3腺病毒、绿色荧光蛋白(GFP)对照腺病毒,感染24 h两组均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h;采用实时荧光定量PCR法检测两组炎性因子[IL-6、前列腺素E2(PGE-2)、趋化因子CXC基序配体9(CXCL-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及MMP-13]表达,采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.取传3～8代成纤维细胞,随机分为RUNX3沉默组和对照组,分别采用脂质体转染法转染siRUNX3、NC-control siRNA,转染24 h两组均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h;采用实时荧光定量PCR法检测IL-6、PGE-2、CXCL-9、MMP-2及MMP-13 mRNA表达.结果 成纤维细胞RUNX3 mRNA相对表达量随着TNF-α浓度升高及作用时间延长而逐渐升高,呈浓度和时间依懒性,以TNF-α浓度50 ng/mL、作用时间24 h时RUNX3 mRNA相对表达量上调为显著(P均<0.05).RUNX3过表达组和对照组穿膜细胞数分别为(56±4)、(20±3)个,两组比较P<0.01.RUNX3过表达组IL-6、PGE-2、MMP-13 mRNA相对表达量均高于对照组(P<0.05或<0.01),两组CXCL-9、MMP-2 mRNA相对表达量比较P均>0.05.RUNX3沉默组IL-6、CXCL-9、MMP-2及MMP-13 mRNA相对表达量均低于对照组(P均<0.05),两组PGE-2 mRNA相对表达量比较P>0.05.结论 TNF-α可促进成纤维细胞RUNX3表达,并呈浓度和时间依赖性;RUNX3表达升高可通过调控IL-6、MMP-13表达而促进成纤维细胞的侵袭能力.
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甘草次酸对胶原诱导性关节炎滑膜成纤维样细胞炎症细胞因子表达和分泌的影响
目的:观察甘草次酸(GA)对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜成纤维样细胞(CIA-FLS) TNF-α、IL-1β表达分泌的影响,并观测与传统治疗药物MTX联合应用后的效果.方法:组织块培养法体外分离纯化CIA大鼠膝关节滑膜组织中CIA-FLS细胞.实验分为空白组、MTX组、GA组和GA+ MTX组4组,分别对CIA-FLS细胞进行体外药物干预实验.每组分别干预1、3、5d.Real time qPCR法检测各组CIA-FLS细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达水平,ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平.结果:药物干预1d,CIA-FLS TNF-α、IL-1β表达均降低,但与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).药物干预3d,CIA-FLS TNF-α、IL-1β表达均降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),3组组间差异无统计学意义(P＞0.05).药物干预5d,CIA-FLS MTX、GA、GA+ MTX均可明显抑制TNF-α、IL-1β表达(P＜0.05),处理组间差异有统计学意义,按照强弱依次是GA+ MTX＞MTX ＞GA( P＜0.05).MTX、GA、GA+ MTX抑制TNF-α、IL-1β表达均呈时效依赖性,作用时间延长,抑制作用越明显(P＜0.05).结论:GA、MTX、GA+ MTX对CIA-FLS炎症因子TNF-α、IL-1β表达和分泌的抑制作用依次递增,并呈时间依赖性.
